EBV潜伏膜蛋白LMP2A诱导鼻咽癌细胞EMT及增加侧群细胞群体的研究

摘要

鼻咽癌在西方国家的发病率为1/100000，在中国广东省的发病率高达30/100000，研究表明其发病因素主要有遗传因素、环境因素及EB病毒感染。EBV属于人类Y疱疹病毒，广泛分布于全球。EB病毒潜伏感染存在于所有的未分化鼻咽癌患者中，并以潜伏感染存在，主要表达潜伏膜蛋白I(LMPl)、EB病毒核抗原(EBNAl)及EBV编码的小RNA(EBERs)以及表达潜伏膜蛋白2(LMP2)。其中LMPI基因为病毒癌基因，通过激活转录核因子-KB(NF-KB)、激活蛋白1以及Janus蛋白激酶，信号转导子与转录激活子信号传导通路而致瘤。但是在鼻咽癌标本中，LMP1在蛋白和转录水平的表达量只有35％和65％，而LMP2A在蛋白和转录水平的表达量高达50％和95％，由此可见，LMP2A在鼻咽癌的发生发展中可能具有极其重要的作用。
　　 研究方法
　　 利用逆转录病毒方法建立稳定表达LMP2A的鼻咽上皮细胞株，RT-PCR、WesternBlot检测LMP2A的表达，免疫荧光方法检测LMP2A的亚细胞定位；Western Blot、免疫荧光检测EMT分子标志物的表达情况；划痕实验、transwell侵袭实验检测细胞的转移侵袭能力；平板克隆、软琼脂克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力；SP流式细胞分析检测细胞的SP细胞含量；动物实验比较细胞的体内成瘤能力。
　　 研究结果
　　 1.稳定高表达LMP2A增强鼻咽上皮细胞的迁移侵袭能力
　　 利用逆转录病毒方法建立了稳定表达LMP2A的鼻咽上皮细胞株，RT-PCR及Western Blot方法证明了LMP2A的稳定表达，免疫荧光实验证明了细胞的业定位状态。通过划痕实验、transwell侵袭实验表明，在鼻咽上皮细胞CNE2、SUNE1稳定高表达LMP2A之后，细胞的迁移侵袭能力大大增强。
　　 2.LMP2A诱导鼻咽上皮细胞发生EMT现象
　　 通过Western Blot及免疫荧光实验显示，稳定高表达LMP2A之后，上皮细胞标志物E-cadherin、Q-catenin明显降低，而间质细胞标志物Fibronectin、Vimentin明显升高，即稳定高表达LMP2A之后，鼻咽上皮细胞CNE2、SUNE1发生了EMT相关的分子改变。
　　 3.LMP2A上调干细胞分子标志物的表达
　　 RT-PCR及Western Blot显示稳定高表达了LMP2A之后，ABCG2、Nanog、SOX2、OCT4表达明显升高。SP流式细胞分析实验表明，转染了LMP2A之后，其SP含量大大增加，鼻咽上皮细胞CNE2、SUNE1中SP含量分别从5％、1.1％升高到了20.9％、7.8％。
　　 4.LMP2A增强鼻咽上皮细胞的体外克隆形成能力及体内成瘤能力
　　 平板克隆形成实验及软琼脂克隆形成实验表明，稳定高表达LMP2A之后，形成的克隆数目、克隆大小都比对照大大增加，由此表明LMP2A大大增强鼻咽上皮细胞的克隆形成能力。裸鼠实验表明，稳定表达LMP2A的细胞无论在成瘤率还是肿瘤牛长速度都大大超过了对照细胞，这种差异随着种入细胞的逐渐减少而更加明显，尤其在1×103的时候，差异最明显。结果表明LMP2A可以大大增强鼻咽上皮细胞的肿瘤形成能力。
　　 5.LMP2A在鼻咽癌标本中的表达水平与ABCG2的表达呈高度相关性。
　　 我们收集了35例鼻咽标本，其中包括15例鼻咽炎症标本和20例鼻咽癌标本。通过实时定量PCR发现，LMP2A在鼻咽炎症标本中的低或无表达，但在大多数鼻咽癌中高表达，ABCG2的表达与LMP2A的表达一致(相关系数为0.95，P值<0.0001)，具有高度统计学意义。同时，通过裸鼠移植瘤及2例鼻咽标本的免疫荧光染色发现，LMP2A与ABCG2的表达定位具有棚似性，二者具有高度相关性。
　　 实验结论
　　 1.LMP2A能够增强鼻咽癌细胞的转移侵袋能力及成瘤能力；
　　 2.LMP2A能够诱导鼻咽癌细胞发生EMT现象；
　　 3.LMP2A可以上调鼻咽癌细胞肿瘤于细胞样细胞群体；
　　 4.LMP2A在鼻咽癌标本中的表达水平与ABCG2的表达呈高度相关性。

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