血-视网膜屏障细胞培养中探索HIV-1gp120的毒性及APOBEC3的分子机制

摘要

本课题研究的4个部分具体内容，简述如下： 第一部分人类血—视网膜屏障细胞的分离、培养及细胞免疫化学特征的鉴定 目的： 本部分的目的在于探索分离、培养出3种HBRBCs的最佳方法，同时进行相关细胞的免疫化学特征鉴定，为进行人类血—视网膜屏障疾病的相关研究提供良好的平台。 方法： 1.人类血—视网膜屏障细胞的分离和培养：取新鲜尸体眼球，分离出视网膜神经层和视网膜色素上皮层，经过特定的组织消化和细胞分离方法，使用不同的选择性培养基分别培养出人类视网膜微血管内皮细胞、人类视网膜微血管周细胞和人类视网膜色素上皮细胞。 2.HBRBCs的免疫化学特征鉴定：用第Ⅷ因子和ZO-1相关抗原抗体免疫组化鉴定所获得的HRCECs；用兔抗人胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体和细胞骨架结构蛋白鉴定HRCPCs；用兔抗人角蛋白多克隆抗体鉴定HRPECs。 3.用CD4，CXCR4和CCR5单克隆抗体鉴定HRCECs和HRCPCs的HIV-1 gp120相关受体表达。 结果： 1、应用不同的选择性培养液和培养技巧，成功地分离、培养了纯度较高的3种HBRBCs： HRCECs、HRCPCs、HRPECs。 2、体外培养的3种HBRBCs可表达各自特征性的蛋白：HRCECs可表达Ⅷ因子和ZO-1紧密连接蛋白，HRCPCs可表达GFAP和α—actin蛋白，HRPECs可表达keratin蛋白。 3、HRCECs的HIV-1 gp120相关受体表达情况：CD4受体为阴性，CXCR4和CCR5为阳性，在细胞浆内和细胞膜上均有分布；而HRCPCs的3种受体表达均为阴性。 结论： 应用不同的选择性培养液和培养技巧，是有效、简便可行的HBRBCs的系统培养分离方法；3种HBRBCs的HIV-1 gp120相关受体表达情况的探明，为进一步探讨HIV侵犯血—视网膜屏障的机制提供了实验基础。 第二部分玻璃体对人类血-视网膜屏障细胞原代培养的影响 目的： 探讨玻璃体液对培养的人视网膜微血管内皮细胞和色素上皮细胞增生的影响。 方法： 1、人玻璃体液制备：玻璃体来源和细胞原代培养取材同时获得，无菌条件下沿赤道部环形剪开眼球，用针将玻璃体拨入小烧杯中，且视网膜及色素组织已分离完全取出。10ml空针抽吸玻璃体多次，0.22μm微孔滤膜过滤，以上操作均在冰浴条件下进行，滤液无菌保存于低温冰箱备用。 2、采用原代培养的第三代HRCECs和HRPECs，分别培养在1:8、1:4、1:2的VCM中，其中VCM分为有无血清2组，在不同作用时间，采用四唑盐比色法检测VCM对人HRCECs和RPE细胞增生的影响。 结果： 1、在有血清时，与对照组比较，1:4、1:2的VCM在培养的各时间段对HRCECs的抑增生作用差异有显著性意义，而对RPE细胞和混合细胞的促增生作用差异有非常显著性意义。 2、在无血清时与对照组比较，1:4VCM组在培养60、72h时以及1:2VCM组在培养24h，HRPECs细胞的增生差异有显著性意义，而1:2VCM组在培养48、60、72h时HRPECs的增生差异有非常显著性意义；1:2VCM组在培养各时间段混合细胞的增生差异有显著性意义，均表现为促增生效应。 结论： 一定体积分数的人VCM抑制HRCECs的增生，但明显促进人RPE细胞以及混合细胞的增生，提示玻璃体中HRPECs细胞浸润是加重外伤增生性玻璃体视网膜病变和眼内血管增生性疾病的高危因素。 第三部分HIV-1 gp120对人类血，视网膜屏障细胞的影响及其分子机制 目的： 观察HIV-1 gp120对HBRBCs的增殖、凋亡和细胞结构的影响，探索在HIV-1相关眼病病变过程中HIV-1 gp120对血—视网膜内屏障破坏的可能机制。 方法： 1、选用并先测定3-4代的HBRBCs的细胞生长曲线。 2、HIV-1 gp120蛋白溶液的配制和分组：取2ug的gp120以无血清培养液稀释为0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.12、0.15μg/ml的HIV-1gp120溶液培养24小时，每个浓度为一组，共7个实验组；或以0.08μg/ml HIV-1gp120溶液培养分别培养4、8、12、24、48、72小时，每个时间为一组，共6个实验组；同时均以无血清培养基为对照组。 3、用MTT法观察gp120蛋白液不同浓度和不同作用时间对原代细胞的生长抑制作用。 4、并用Annexin V—FITC/PI双标记和rhodamine123标记线粒体膜电位，流式细胞仪检测gp120对细胞凋亡率和△ψm的影响。 5、用Western—blot检测Cleaved caspase—9蛋白的活化情况。 6、并用透射电镜观察经gp120处理前后原代细胞超微结构的变化。 结论： HIV-1 gp120能够抑制人血—视网膜屏障细胞的增殖并具有诱导凋亡的作用，通过破坏线粒体的结构和功能是其可能的机制。 第四部分探索人类血—视网膜屏障细胞中IFN—APOBEC3G信号通路 目的： 本部分检测HBRBCs中APOBEC3家族的表达情况，分析其表达的多样性，同时研究干扰素(IFN)—γ对APOBEC3G表达的影响，探索IFN—APOBEC3G信号通路能否为防止HIV等病毒破坏血—视网膜屏障并彻底清除病毒储存库提供有效策略。 方法： 1、HBRBCs的APOBEC3A—G基因的检测：对3种HBRBCs进行总RNA的提取，cDNA第一链的合成，设计APOBEC3A—G引物对，分别使用RT—PCR和real—time—PCR对APOBEC3A—G基因进行检测。 2、HBRBCs中APOBEC3G/3F蛋白表达的检测：采用了抗APOBEC3G和APOBEC3F的兔多克隆抗体，通过Western blot对HRCECs，HRCPCs，HRPECs、神经上皮层、色素上皮层和全层视网膜组织中的APOBEC3G和APOBEC3F蛋白表达水平进行检测。 3、IFN—γ对原代培养HRCECs的APOBEC3G表达的影响：使用了单剂量浓度渐增的IFN—γ(0，150，300，600和1200U/ml)对HRCECs进行干预培养后，分别将IFN—γ处理后不同时间点(6，12，24和48小时)的细胞溶解并采用Western—blot分析。 结果： 1、半定量的RT—PCR分析APOBEC3在HBRBCs的表达情况：所有的HBRBCs中都有很强的APOBEC3B，APOBEC3C，APOBEC3F和APOBEC3G的mRNA表达，但没有APOBE3A和APOBEC3D的mRNA表达。 2、Real—time PCR分析APOBEC3表达情况：APOBEC3B，APOBEC3C，APOBEC3F和APOBEC3G在HBRBCs中均有表达，但APOBE3A和APOBEC3D的表达阴性，这个结果印证了RT—PCR的结果。 3、Western blot分析APOBEC3G/3F蛋白的表达情况：所有的HBRBCs细胞中均有APOBEC3G和APOBEC3F(～46kDa)的强烈蛋白表达。神经上皮层、色素上皮层和全层视网膜组织中APOBEC3G和APOBEC3F蛋白也有表达，水平比HBRBCs高，而且色素上皮层检验到的信号比其它的组织层都高。 4、不同剂量的IFN—γ分析发现，使用单剂量300 U/ml IFN—γ处理HRCECs后，APOBEC3G蛋白表达水平在12小时内便被提高了；当剂量增加到600U/ml时，IFN—γ诱导APBOBE3G蛋白表达的效应最高，大于此剂量浓度时，APBOBEC3G的蛋白水平便不再增加；更高剂量的IFN—γ，如1200U/ml来处理原代培养的HRCECs细胞，干扰素对细胞的任何毒性作用，细胞的形态和数量都保持正常。而不同的作用时间分析发现，300U/ml单剂量的IFN—γ在12小时内增强APBOBE3G蛋白的表达，24小时内表达量继续上升，而到了48小时后就不再增加了。 结论： 1、HBRBCs中只有部分APOBEC3基因家族成员被检测到，而且APOBEC3蛋白表达水平在新鲜的视网膜组织中要比在长期培养的细胞中高； 2、细胞因子IFN—γ能诱导上调HRCECs中APOBEC3G的表达； 3、进一步探明IFN—APOBEC3G信号通路可为防止HIV-1等病毒破坏血—视网膜屏障并彻底清除病毒储存库提供有效策略。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写索引

声明

前 言

一、研究背景和立题依据

1)全民动员防治艾滋病

2)HIV感染与血-视网膜屏障

3)人类血-视网膜屏障细胞的原代培养

4)表面蛋白gp120结构及其在HIV致病过程中的重要作用

5)APOBEC3G的抗病毒作用与细胞免疫的分子屏障

二、本课题的研究目标和意义

第一部分人类血-视网膜屏障细胞的分离、培养及细胞免疫化学特征的鉴定

1材料和方法

2结 果

3讨 论

4 小 结

第二部分 玻璃体对人类血-视网膜屏障细胞原代培养的影响

1材料和方法

2结 果

3讨 论

4 小 结

第三部分HIV-1 gp120对人类血-视网膜屏障细胞的影响及其分子机制

1材料和方法

2结 果

3 讨 论

4 小 结

第四部分 探索人类血-视网膜屏障细胞中IFN-APOBEC3G信号通路

1材料和方法

2结 果

3讨 论

4小 结

全文结论

本课题创新点

研究展望

参考文献

在学期间发表的论文

致谢