胚胎干细胞条件培养液促进人角膜缘干细胞干性维持的实验研究

摘要

本研究旨在本课题组前期研究基础上在无血清无饲养层培养条件下添加一定含量ES细胞培养上清液作为条件培养液（ESC-CM），进行小组织块HLCEC体外培养，探讨该体系对人角膜缘干细胞生物学特性（形态、细胞表型）和功能（增殖，凋亡，分化，粘附，移行）的影响，并初步探讨ESC-CM促进人角膜缘干细胞干性功能维持的机理，以期建立一种利用少量自身细胞原代培养获得具有更强干性功能的细胞，从而满足组织工程器官构建和临床细胞治疗的需要。
　　 方法
　　 利用组织块法取材并培养人角膜缘上皮细胞，CnT-20及添加20％浓度胚胎干细胞培养液为对照组，添加20％浓度胚胎干细胞培养上清液为实验组进行小组织块人原代角膜缘上皮细胞培养，通过形态学及RT-PCR、免疫荧光对K3、P63、ABCG2等mRNA及蛋白表达情况进行细胞鉴定。克隆形成检测试验检测细胞增殖，流式细胞技术检测细胞周期及凋亡情况，Adhersion assay及Migration assay检测细胞粘附及移行能力，气-液刺激促进复层形成，HE染色观察复层形成情况，透射电镜观察细胞表面微绒毛、细胞间桥粒连接及紧密连接情况，秋水仙素法测定核型，Parachute assay检测细胞间缝隙连接情况，通过LY294002单独及联合SB203580、PD98059进行相关通路阻断。并通过Western Blot检测三组细胞阻断前后integrinβ1、FAK、pFAK、Akt、pAkt蛋白表达情况。Fluro-4-AM负载检测20％ESC Medium及20％ESC-CM对细胞内钙离子浓度的影响，进一步探讨20％ESC-CM促进人角膜缘干细胞干性维持的可能机制。
　　 结果
　　 本实验发现在无血清无饲养层条件下建立的ES-CM体系获得的HLCEC细胞可在体外培养八代以上。胚胎干细胞培养液起到了部分模仿HLCEC微环境的作用，所得原代细胞中干细胞/祖细胞含量增多，具有更强粘附及移行功能并在接下来的传代培养中使细胞干性至少保持6代。P8代细胞在体外能够形成具有良好功能的复层细胞片。且integrinβ-1及磷酸化FAK，磷酸化Akt表达升高。同时，我们发现ESC-CM可以促进细胞内钙离子浓度一过性升高，提示该体系可能在上调integrinβ-1表达后，通过细胞内钙离子浓度的升高促进其集簇化，并与体系中大量的细胞外基质成分结合，进一步上调并激活下游分子FAK，促进细胞粘附及移行。同时，我们发现，阻断P13K/Akt通路后，HLCEC增殖能力下调，干细胞相关功能蛋白ABCG2及p63表达下调，同时K3表达上调。
　　 结论
　　 无血清无饲养层条件下建立的ES-CM体系起到了部分模仿HLCEC微环境的作用，获得的细胞具有更强粘附、移行及增殖能力，并在接下来的传代培养中使细胞干性至少保持6代。提示该体系可能在上调integrinβ-1表达后，通过细胞内钙离子浓度的升高促进其集簇化，进一步上调并激活下游分子FAK，促进细胞粘附及移行。同时，通过P13K/Akt调节细胞干性。本培养体系能够为再生医学研究提供充足的低免疫原性，高干性的自体种子细胞，在治疗眼表疾病方面有良好的应用前景。

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结 论

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参考文献

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