Toll样受体TLR2和TLR4的激活对小鼠骨髓间质干细胞免疫调节作用的影响

摘要

骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓基质中的非造血成体干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能，不表达主要组织相容性复合物Ⅱ类抗原和共刺激分子，MSCs的这些特性使其被应用于多种疾病的临床治疗研究当中，如成骨不全，心肌梗塞等。同时，近年来研究表明MSCs还具有免疫调节功能，其对于同种异基因骨髓移植后的移植物抗宿主病(GVHD)的治疗作用受到越来越多的关注。然而MSCs的免疫调节作用机制仍然不明确，限制了其在临床的广泛应用，有研究认为细胞因子、趋化因子和其他炎症介质可能介导MSCs的免疫调节效应。
　　 Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是一类天然免疫模式识别受体，特异性识别病原微生物(如细菌、病毒、真菌)中的病原相关分子模式(PAMPs)，例如：TLR2识别革兰氏阳性菌的脂蛋白、肽聚糖和脂磷壁酸质类；TLR3识别病毒的双链RNA；TLR4识别革兰氏阴性菌的脂多糖、热休克蛋白和细胞外基质等内源性分子。目前已有十余种TLRs被发现，MSCs上也有功能性TLRs的表达，研究表明，MSCs上TLRs与内源性或外源性TLR配体相结合后能激活下游信号分子，介导细胞因子和趋化因子(如IL-6、IL-8、CXCL10)的分泌，并影响MSCs的增殖、分化以及免疫调节效应。由于MSCs在治疗GVHD中的应用，移植的MSCs不可避免地会遭遇来自感染、炎症等“危险信号”的刺激，因此深入探讨TLRs激活对MSC免疫调节效应的影响具有重要意义。为此，本实验研究TLR2和TLR4与相应配体Pam3cys、LPS结合被激活后，对小鼠MSCs的迁移、抑制淋巴细胞增殖以及上调CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例等方面的影响，并初步探讨其可能的作用机制。本课题的实验内容包括两部分：
　　 第一部分：C57BL/6小鼠骨髓来源MSCs的体外分离、培养及鉴定(包括表面标记和多向分化能力)。
　　 第二部分：通过流式细胞亚群分析、Transwell迁移试验及单向混合淋巴细胞反应等实验研究TLR2和TLR4的激活对小鼠MSCs免疫调节作用的影响，并进一步通过ELISA和荧光定量real-timePCR探讨其可能的作用机制。
　　 第一部分小鼠骨髓MSCs的体外分离、培养及鉴定
　　 1.方法
　　 取C57BL/6小鼠的股骨，冲洗骨髓腔获得骨髓细胞，裂解红细胞后用L-DMEM培养基进行贴壁培养，借助MSCs的贴壁特性，反复换液、弃悬浮细胞，待贴壁细胞接近融合时进行胰酶消化传代，逐步获得形态均一的mMSCs。对体外培养的mMSCs进行形态学的观察，利用流式细胞仪检测mMSCs表面标记，并通过定向诱导mMSCs分化为成骨细胞和脂肪细胞来对其进行鉴定。
　　 2.结果
　　 细胞接种后6～10左右天可见有贴壁细胞，形态呈短梭形，并逐渐形成细胞克隆，接近融合后进行消化传代，约8-9周后可获得形态均一的mMSCs。流式细胞仪检测所获得的mMSCs上Sca-1、CD44呈阳性表达，不表达CD45、CD11b、CD117及MHC-Ⅱ。
　　 在对mMSCs进行成骨诱导的10～12天左右光镜下可见致密团块样的结节形成，结节大小不等，诱导14天进行茜素红染色，结节被染为橘红色，证实为钙结节。mMSCs成脂诱导的4～6天左右光镜下可见细胞中出现圆形小脂滴，随着诱导时间的延长小脂滴逐渐聚集成大的脂泡，诱导12天对其进行油红O染色可见脂滴被染成红色。
　　 3.结论
　　 从小鼠的骨髓中成功分离、培养出mMSCs，呈短梭形，贴壁生长，具有较强的增殖能力；对得到的mMSCs的表型分析结果显示Sca-1、CD44呈阳性表达，不表达CD45、CD11b、CD117及MHC-Ⅱ，并证实其在经过诱导后可以向成骨细胞及脂肪细胞分化，具有多向分化潜能。
　　 第二部分TLR2和TLR4的激活对mMSCs免疫调节作用的影响
　　 1.方法
　　 通过Transwell实验观察Pam3cys、LPS(分别为TLR2和TLR4相应配体)对mMSCs迁移的影响；通过单向混合淋巴细胞反应(single-direction allo-mixed lymphocytes reaction，MLR)，探讨TLR2和TLR4激活后的对mMSCs调控淋巴细胞增殖和CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)产生的影响；ELISA检测趋化因子CXCL-10的分泌差异，并通过荧光定量PCR检测CXCL-10、iNOS的表达，探讨TLRs介导mMSCs免疫调节效应的可能机制。
　　 2.结果
　　 2.1TLR2、TLR4相应配体对于mMSCs迁移的影响。
　　 Transwell实验中，TLR2配体Pam3cys可抑制mMSCs的定向迁移，并且这种抑制作用随着Pam3cys浓度的增加而增加，然而TLR4配体LPS对mMSCs的迁移无明显影响。
　　 2.2TLR2、TLR4激活对mMSCs调控MLR和CD4+CD25+Foxp3+T细胞的产生有不同影响。
　　 在单向混合淋巴细胞培养体系，TLR2激活可显著削弱mMSCs对同种混合淋巴细胞反应的抑制，并抑制Treg细胞产生(8.83％±1.02vs15.12％±1.02；p＜0.05)；而TLR4激活则对mMSCs调控同种混合淋巴细胞反应和Treg细胞产生无明显影响。
　　 2.3TLR2、TLR4的激活对CXCL-10的表达和分泌以及iNOS表达的影响。
　　 同未处理mMSCs组相比，TLR2激活可显著降低mMSCsCXCL-10的分泌；而TLR4激活对mMSCsCXCL-10的分泌无明显影响。定量PCR结果进一步显示，在混合淋巴细胞与不同预处理的mMSCs共培养的各时间点，同未处理mMSCs或LPS处理mMSCs相比，Pam3cys处理的mMSCs上CXCL-10的表达均维持在较低水平；而iNOS的表达则高于未处理mMSCs及LPS处理后mMSCs。
　　 3.结论
　　 3.1TLR2配体抑制mMSCs的迁移，这种作用呈剂量依赖性，而TLR4配体对mMSCs的迁移没有明显影响。
　　 3.2TLR2的激活削弱了mMSCs对于同种异基因刺激的淋巴细胞增殖的抑制作用，同时降低了MLR体系中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例，而TLR4的激活无明显作用。
　　 3.3TLR2的激活降低了趋化因子CXCL-10的表达和分泌，而TLR4的激活对CXCL-10无明显影响。TLR2激活后CXCL-10表达降低而iNOS则高表达，表明TLRs的激活对mMSCs免疫调节作用的影响并不是通过影响CXCL-10与iNOS的协同作用来实现，其详细机制有待进一步阐明。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写表

声明

引 言

第一部分 小鼠骨髓MSCs的体外分离、培养及鉴定

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第二部分 TLR2和TLR4的激活对mMSCs免疫调节作用的影响

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

全文小结

参考文献

附录 硕士期间发表论文情况

致 谢