肝再生磷酸酶-3表达对肝细胞癌进展及生物学行为的影响

摘要

研究背景：
　　 肝细胞癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，位列全球癌症死因的第三位，我国癌症死因的第二位。尽管诊断治疗技术有了很大的进步，但由于治疗后肿瘤易复发，所以肝癌病人的预后仍不理想。促使肝癌复发的相关因素有多种，尤其是肿瘤的门静脉侵犯。但与肝癌血管侵犯和肿瘤复发的分子机制尚不清楚。因此，寻找与肝癌血管侵犯有关，且能预测肿瘤复发和不良预后的分子标志物，不仅能指导临床治疗方法的选择，而且有可能为干预肝癌的复发转移提供新的治疗靶点。
　　 蛋白酪氨酸的磷酸化与去磷酸化分别受蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosinekinases，PTKS)和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)的催化，是细胞生长、分化等生命活动的重要调节方式，这两种酶的作用失衡可导致蛋白酪氨酸的磷酸化水平异常，从而引起肿瘤或非肿瘤性疾病的发生。肝再生磷酸酶(phosphatases of regenerating liver,PRLs)属于PTP家族新成员，包括PRL-1、PRL-2、PRL-3三种类型。近年来，越来越多的证据显示PRL-3的表达升高与人类多种恶性肿瘤的转移复发和相关病人的不良预后有关。有研究发现PRL-3在肝癌组织中的表达水平普遍高于正常肝组织，但目前尚无关于PRL-3表达与肝细胞癌生物学行为间关系的研究。
　　 目的：
　　 1、探讨PRL-3在肝癌细胞和组织内的表达水平及其与肝细胞癌恶性进展，尤其是与门脉内癌栓形成之间的关系。
　　 2、构建靶向PRL-3基因的RNAi重组慢病毒载体，筛选出最佳干扰靶点并包装获得相应的慢病毒。为研究PRL-3基因表达水平与肝癌细胞生物学行为间的关系搭建技术平台。
　　 3、研究PRL-3表达水平下调引起的肝癌细胞生物学行为改变，以期为肝细胞寻找基因治疗的心方法。
　　 方法：
　　 1、通过免疫荧光细胞化学、Real-Time PCR技术检测肝癌细胞系中PRL-3基因在mRNA水平和蛋白水平的表达情况并筛选出表达水平最高的细胞。
　　 2、免疫组织化学的方法检测PRL-3在肝癌原发灶和门静脉癌栓中的表达情况，分析其与肝癌临床病理特点，特别是血管侵犯的关系。
　　 3、设计4个靶向PRL-3基因的RNAi序列和一个阴性对照序列，合成各自的双链寡核苷酸，构建相应的重组慢病毒质粒载体并分别命名为Lentivirus/CMV/GFP-KD1、2、3、4和Lentivirus/CMV/GFP-NC。行PCR和DNA测序鉴定。
　　 4、将四个靶点质粒和一个阴性对照质粒分别进行小量慢病毒包装并分别感染肝癌HepG2细胞，根据Real-Time PCR检测所得的PRL-3 mRNA的抑制效率确定最佳RNAi序列。
　　 5、携带阴性对照序列和最佳RNAi序列的重组慢病毒的大量包装并根据GFP的表达水平用稀释法进行病毒滴度测定。
　　 6、Real-Time PCR和Western Blot分别检测最佳靶点病毒感染后SMCC7721细胞中PRL-3基因的沉默效果。
　　 7、CCK-8增殖实验检测PRL-3基因敲除对SMCC7721细胞体外增殖能力的影响。
　　 8、流式细胞术检测PRL-3基因敲除对SMCC7721细胞周期分布的影响。
　　 9、Transwell迁移实验检测PRL-3基因敲除对SMCC7721细胞体外迁移能力的影响。
　　 10、Transwell侵袭实验检测PRL-3基因敲除对SMCC7721细胞体外迁移能力的影响。
　　 结果：
　　 1、Real time PCR的方法检测发现PRL-3广泛表达于肝癌细胞，其中SMCC7721细胞中表达水平最高，HepG2细胞中次之。细胞免疫荧光检测发现PRL-3主要表达于肝癌细胞的胞浆和包膜。
　　 2、免疫组化检测表明PRL-3在肝癌原发灶的表达阳性率为70.2％(174/248)，主要位于肝癌细胞的细胞浆和细胞膜。PRL-3的表达与肝细胞癌患者的血清甲胎蛋白水平(P=0.028)、肿瘤大小(P=0.007)、病理分化程度(P=0.04)及肿瘤分期(P=0.001)等密切相关。其中，伴门静脉癌栓形成的肝癌原发灶中PRL-3的阳性表达率(84.4％，38/45)明显高于无门静脉癌栓形成的肝癌原发灶(67％，136/203)，两者间的差异有统计学意义(P=0.021)。PRL-3在门静脉癌栓中的阳性表达率(97.8％，44/45)明显高于相应的原发灶(84.4％，38/45)，两者间的差异有统计学意义(P=0.029)。门静脉癌栓形成的百分比在PRL-3表达阳性病人中要远高于在PRL-3表达阴性的病人(21.8％ vs9.5％，HR2.674，P=0.025).另外，肿瘤的大小(HR2.732，P=0.009)和病理分化程度(HR7.778，P＜0.001)也与门脉癌栓形成密切相关。多因素分析结果显示PRL-3表达阳性病人形成门脉癌栓的风险几乎是PRL-3表达阴性病人的2.2倍(HR2.171，P=0.113，)。
　　 3、阳性克隆PCR产物琼脂糖电泳和DNA测序显示鉴定结果与预期相符。成功地构建了PRL-3 shRNA的重组慢病毒表达质粒。
　　 4、各靶点病毒分别感染HepG2细胞后，Real-time PCR检测结果显示：Lentivirus/CMV/GFP-KD1对目的基因的敲减效率最高，大于90％，为最佳靶点。
　　 5、大量包装的最佳靶点病毒Lentivirus/CMV/GFP-KD1和阴性对照病毒Lentivirus/CMV/GFP-KD1浓缩液滴度为6E+8Tu/ml。和对照组相比，Lentivirus/CMV/GFP-KD1感染的SMCC7721细胞中PRL-3 mRNA和蛋白表达量分别减少75％和63％。
　　 6、CCK-8细胞增殖实验结果显示：SMCC7721组和SMCC7721-NC两组OD值比较，统计学上无差异(P＞0.05);SMCC7721-KD1组分别和SMCC7721组、SMCC7721-NC的OD值比较，统计学上有显著差异(P＜0.05)。说明PRL-3表达下调以后，细胞增殖受到影响，增殖变慢。
　　 7、流式细胞仪检测细胞周期分布结果显示：SMCC7721-KD1组分别和SMCC7721-CON组、SMCC7721-NC组的G0/G1期、S期、G2/M期比较，统计学上无显著差异(P＞0.05)。
　　 8、Transwell迁移实验发现PRL-3特异性siRNA感染的SMCC7721-KD1组细胞迁移的平均细胞数(28.3±1.5个)明显少于空白对照SMCC7721-CON组(65.0±3.3个)及阴性对照SMCC7721-NC组(63±1.7个)，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　 9、Transwell侵袭实验PRL-3特异性siRNA感染的SMCC-7721细胞穿过人工基底膜的平均细胞数(14.2±0.8个)明显少于空白对照组(33.0±1.6个)及非特异性siRNA感染组(31.2±0.8个)，侵袭抑制率为58％，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　 结论：
　　 1、PRL-3基因在肝癌组织和细胞中广泛表达，且与肝细胞癌的恶性进展和血管侵犯密切相关，并可能与肝癌的复发有关。
　　 2、成功构建了靶向沉默PRL-3基因的重组慢病毒载体。筛选出了最佳靶点并获得了高滴度的重组慢病毒，为PRL-3基因功能的进一步研究奠定了基础。
　　 3、RNA干扰PRL-3基因的表达可抑制肝癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力。
　　 4、PRL-3有望成为肝癌恶性进展的良好标志物和治疗靶点。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照

声明

前言

第一部分PRL-3在肝癌组织和细胞中的表达及其与临床病理特性间的关系

1.1材料和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4结论

第二部分慢病毒介导RNA干扰抑制肝癌细胞PRL-3基因和蛋白表达方法的建立

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4结论

第三部分慢病毒介导靶向PRL-3基因的RNA干扰对肝癌SMCC7721细胞的体外抑制作用

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4结论

课题创新之处

参考文献

附录

致谢