SD大鼠类胚胎干细胞的分离培养与初步鉴定

摘要

自1981年成功地建立第一个小鼠胚胎干细胞(mES细胞)系以来，各国科学家将目标定在大鼠胚胎干细胞的建系上，以期得到更接近人类的疾病动物模型。但由于体外培养时，不能完全抑制大鼠胚胎干细胞(rES细胞)分化，这个问题一直以来困扰着科研人员。2008年底一科研小组采取了一种特殊的“信号阻断”方法，成功在体外培养出rES细胞。在这之后，许多国家的科研小组利用诱导多能干细胞技术等方法对rES细胞进行体外分离培养。本研究旨在尝试分离大鼠类ES细胞，在体外有饲养层和无饲养层条件下进行初步培养，研究两种小分子抑制剂对其分化的抑制作用；同时加入鱼卵提取液以及子宫内膜，观察其对rES细胞增殖的影响，从而对适宜rES细胞的培养体系进行探索，并结合本实验对rES体外培养的影响因素进行分析，为下一步培养建立大鼠ES细胞系提供实验研究基础。通过研究，我们得出以下结论：
　　 (1)通过对大鼠和小鼠的胚胎成纤维细胞进行培养，证实两种胚胎成纤维细胞增殖较为旺盛，3～5代的细胞经丝裂霉素C处理后，适宜大鼠胚胎的快速贴附生长。而大鼠骨髓间充质干细胞经处理后，细胞状态维持时间短，不适宜制作饲养层。
　　 (2)本实验发现大鼠和小鼠的3～5代胚胎成纤维细胞经丝裂霉素C处理后均可作为大鼠类ES细胞增殖的饲养层细胞，且对其增殖无显著差异。
　　 (3)本实验对怀孕3.5-5.5天的大鼠胚胎进行比较，发现4.5天的大鼠胚胎质量最好，能够分离出较多大鼠类ES细胞；3.5天的大鼠胚胎增殖缓慢，透明带和滋养层尚未脱落细胞已大部分死亡；5.5天的大鼠胚胎分离出的类ES细胞大部分分化成上皮型细胞。
　　 (4)全胚培养法所培养的大鼠类ES细胞具有三个特性：核质比高，多核仁，细胞质中有较多的小囊泡。ES细胞克隆的形态是细胞紧密聚集，界限不清，边缘光滑，克隆表面折光性颗粒多，圆形或椭圆形，形似鸟巢，集落与饲养层界限分明。
　　 (5)普通ES细胞培养基下，大鼠类ES细胞出现分化，ES细胞的形态学特性消失。在两种抑制剂(2i)条件培养基下，大鼠类ES细胞增殖缓慢，容易死亡。2i+鱼卵提取液培养基下，大鼠类ES细胞增殖速度快。
　　 (6)在培养早期发现，在含有子宫内膜混合物的条件下，大鼠类ES增殖速度快。
　　 (7)未分化的大鼠类ES细胞碱性磷酸酶(AKP)活性呈阳性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 前言

1、ES细胞的来源

2、ES细胞的生物学特性

3、ES细胞的表面标志及其检测

4、人和几种常用哺乳动物ES细胞的研究历史

5、大鼠ES细胞的研究进展

6、影响动物ES细胞体外分离培养的因素

7、ES细胞的研究与应用价值

8、胚胎干细胞研究存在的问题

第二部分 实验研究

第一章 饲养层细胞的选择与制备

引言

1、实验材料与器材

2、实验步骤与方法

3、结果

4、结论

5、讨论

第二章 大鼠类胚胎干细胞(rESCs)的分离培养

引言

1、实验材料与器材

2、实验步骤与方法

3、结果

4、结论

5、讨论

第三章 大鼠类胚胎干细胞(rES)的初步鉴定

引言

1、实验材料与器材

2、实验步骤与方法

3、结果

4、结论

5、讨论

参考文献

第三部分：附录部分

致 谢