实验兔糖尿病性心肌病心脏舒张功能不全CML和Titin的改变及坎地沙坦酯的作用

摘要

本研究分成三部分：第一部分，建立1型糖尿病兔模型，通过自身对照，使用心脏彩色多普勒检测心脏功能变化，了解高糖血症致心脏功能变化的特点，确定形成糖尿病性心肌病左室舒张功能不全的时间；第二部分，分组对照试验，探讨糖尿病兔在心脏舒张功能不全时CML和心肌titin的变化，及其他常见室壁僵硬度相关因素改变；第三部分，药物干预试验，在糖尿病兔成模后即予低剂量和高剂量的坎地沙坦酯口服，观察药物对糖尿病致心脏舒张功能不全的影响，并探讨其作用环节。
　　 第一部分实验兔糖尿病性心肌病心功能变化特征
　　 一.目的
　　 了解四氧嘧啶致1型糖尿病兔模型心功能的发展规律，确定糖尿病性心肌病出现射血功能正常的心脏舒张功能不全的时间。
　　 二.方法
　　 建立四氧嘧啶致1型糖尿病兔模型。使用自身对照方法，按时间顺序分别在成模前、成模后2周、4周、6周行心脏彩色多普勒检查，确定各时间段心脏功能的变化特征。统计学分析实验数据。
　　 三.结果
　　 心脏多普勒动态观察糖尿病兔心脏功能改变：与成模前自身对照，成模后2周各指标无明显改变(P＞0.05)；4周出现E/A比值倒置，EDT延长(P＜0.05)，EF、LVFS无变化(P＞0.05)；6周出现EF、LVFS值下降(P＜0.05)。
　　 四.结论
　　 四氧嘧啶致1型糖尿病兔模型可出现心脏功能进行性下降，早期表现为舒张功能不全，晚期出现收缩功能下降。成模后4周表现为EF正常的左室舒张功能不全。
　　 第二部分实验兔糖尿病性心肌病心脏舒张功能不全时室壁被动僵硬度相关因素变化
　　 一.目的
　　 探讨四氧嘧啶致1型糖尿病兔心脏舒张功能不全阶段，心脏的结构和功能变化特点。分别检测室壁僵硬度相关因素：心肌细胞大小、心肌间质纤维化程度、胶原可溶性、CML-AGEs沉积和心肌titin的变化，探讨糖尿病性心肌病舒张功能不全的发生机制。
　　 二.方法
　　 1、实验分组：非对称地随机分为对照组(C组)10只，糖尿病组(D组)15只。
　　 2、成模后4周行心脏彩色多普勒检查和左室导管并多巴酚丁胺负荷实验，检测心脏功能。
　　 3、采集血标本测定一般生化指标，放射免疫法测定血浆血管紧张素Ⅱ和醛固酮水平。
　　 4、采集心肌标本分别行：
　　 (1)病理检查：HE染色，测量心肌细胞横切面积(cross-sectiona1 area,CSA)；Masson染色，计算胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)；透射电镜观察超微结构改变。
　　 (2)放射免疫法测定心肌组织血管紧张素Ⅱ水平。
　　 (3)酸水解法测羟脯氨酸，计算心肌可溶性胶原纤维比例。
　　 (4)免疫组化定量测定CML-AGEs沉积。
　　 (5)titin检测：real time PCR法定量测定总titin、titin N2B和titin N2BA的mRNA表达；垂直电泳并染色测定总titin、titin N2B和titin N2BA的蛋白表达。
　　 5、统计学分析实验数据。
　　 三.结果
　　 1、左心功能评价：
　　 (1)心脏多普勒结果：糖尿病组与正常组相比E/A比值倒置，EDT延长(P＜0.05)，EF、LVFS无变化(P＞0.05)。
　　 (2)血流动力学结果：糖尿病组与正常组相比LVEDP和T值升高，LV-dp/dtmax降低(P＜0.05)；LVSP、LV+dp/dtmax无明显变化(P＞0.05)。
　　 (3)多巴酚丁胺负荷实验：正常组在多巴酚丁胺刺激下随剂量增多，LV±dp/dtmax均增强，尤以收缩功能增强为主；糖尿病组在中等剂量的多巴酚丁胺刺激下已开始出现LV+dp/dtmax下降，LV-dp/dtmax无改善。
　　 2、左心形态学改变：
　　 (1)大体形态学改变：糖尿病组与正常组相比，心脏多普勒检测左室各室壁厚度及室腔大小无统计学差异(P＞0.05)，左心室重量指数无统计学差异(P＞0.05)。
　　 (2)细胞形态学改变：与正常组相比，糖尿病组HE染色无心肌肥大表现，心肌细胞直径无统计学差异；透射电镜检测可见糖尿病组少量肌丝呈局灶性溶解，部分线粒体肿胀、空泡化，肌纤维间脂滴堆积。
　　 3、心肌间质胶原纤维改变：
　　 (1)胶原纤维含量测定：Masson染色显示糖尿病组与正常组相比胶原含量稍增多，但CVF无统计学差异。
　　 (2)胶原纤维可溶性测定：糖尿病组与正常组相比可溶性胶原纤维含量明显下降(P＜0.05)。
　　 4、CML-AGEs免疫组化定量检测：糖尿病组与正常组相比细胞间质CML沉积数量明显增多(P＜0.05)。CML平均光密度值(mean density,score/mm2)与血流动力学指标T呈线性相关关系(r=0.797，P＜0.05)。
　　 5、心肌titin的改变
　　 (1)蛋白定量检测：糖尿病组与正常组相比，总titin量和N2B/N2BA无统计学差异(P＞0.05)。
　　 (2) mRNA定量检测：糖尿病组与正常组相比，总titin、titin N2B、titinN2BA的mRNA表达均明显上调(P＜0.05)。
　　 四.结论
　　 1、四氧嘧啶致1型糖尿病兔可呈糖尿病性心肌病病理改变，成模后4周表现为左室射血功能保留的舒张功能不全。
　　 2、CML-AGEs增多与糖尿病性心肌病早期心脏舒张功能不全相关。
　　 3、在糖尿病性心肌病早期舒张功能不全阶段，titin转录增强，但蛋白总量和亚型比例无明显变化。
　　 第三部分坎地沙坦酯对糖尿病兔心脏舒张功能不全影响
　　 一.目的
　　 研究坎地沙坦酯对实验性兔糖尿病性心肌病舒张功能不全的影响及其作用环节。
　　 二.方法
　　 1、建立四氧嘧啶致1型糖尿病兔模型。
　　 2、随机分组：糖尿病坎地沙坦低剂量组(简称低剂量药物组，DLA组)15只和糖尿病坎地沙坦高剂量组(简称高剂量药物组，DHA组)15只。在成模后3天开始给予坎地沙坦酯口服，口服剂量：DLA组1mg/kg/d，DHA组5mg/kg/d。
　　 3、成模后4周行心脏功能检测，血标本检测和心肌标本检测，检测指标和方法同第二部分。
　　 4、统计学分析实验数据，正常组、糖尿病组、DLA组和DHA组四组间采用单因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)。若方差分析有统计学意义，采用LSD-t检验进行两两比较。
　　 三.结果
　　 1、左心功能评价：
　　 (1)心脏多普勒结果：两药物组比较各指标无明显差异(P＞0.05)。两药物组与糖尿病组相比均表现为E值升高，A值下降，E/A倒置逆转，EDT延长缩短(P＜0.05)。与正常组相比仍有E值下降，A值升高，E/A比值降低，EDT延长(P＜0.05)。
　　 (2)血流动力学结果：DHA组血压明显下降(P＜0.05)，其余指标两药物组间无明显差异(P＞0.05)。两药物组与糖尿病组相比LVEDP降低，LV-dp/dtmax和T值较前改善(P＜0.05)。与正常组相比上述指标无统计学差异(P＞0.05)。
　　 (3)多巴酚丁胺负荷实验：DLA组随多巴酚丁胺剂量增多LV±dp/dtmax有增强；DHA组随多巴酚丁胺剂量增多LV±dp/dtmax无变化。
　　 2、左心形态学改变：
　　 (1)大体形态学改变：四组间比较心脏多普勒检测左室各室壁厚度及室腔大小无统计学差异(P＞0.05)，左心室重量指数无统计学差异(P＞0.05)。
　　 (2)细胞形态学改变：四组间比较心肌细胞直径无统计学差异；透射电镜检测DLA组和DHA组肌丝与线粒体改变与糖尿病组相似，但肌纤维间脂滴堆积较糖尿病组明显减少。
　　 3、心肌间质胶原纤维改变：
　　 (1)胶原纤维含量测定：正常组、糖尿病组、DLA组和DHA组的CVF(％)分别为：4.7±1.2，5.9±1.3，5.2±2.1，5.3±1.8(P＞0.05)，无统计学差异。
　　 (2)胶原纤维可溶性测定：正常组、糖尿病组、DLA组和DHA组的的心肌组织可溶性胶原纤维含量(％)分别为：50.22±2.99，40.43±2.75，46.08±3.05，48.54±3.04(P＜0.05)。两药物组间无统计学差异。两药物组可溶性胶原纤维含量均较糖尿病组升高，具统计学意义。
　　 4、糖基化终产物CML免疫组化定量检测：正常组、糖尿病组、DLA组和DHA组的平均光密度值(mean density,score/mm2)分别为：15.59±1.88，40.89±3.01，29.52±4.22，24.8±2.97(P＜0.05)。两药物组间无统计学差异。两药物组CML较糖尿病组明显减少，具统计学意义。
　　 5、心肌肌联蛋白titin的改变
　　 (1)蛋白定量检测：四组间比较总titin和N2B/N2BA亚型比值无统计学差异(P＞0.05)
　　 (2) mRNA定量检测：两药物组与正常组相比，总titin、titin N2B、titinN2BA的mRNA表达均明显上调(P＜0.05)。两药物组与糖尿病组相比无统计学差异。
　　 四.结论
　　 在糖尿病早期阶段，使用坎地沙坦酯可部分逆转左室舒张功能不全，其作用独立于其降压效果，可能机制为减少高糖导致的CML-AGEs在心肌间质的沉积。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分实验兔糖尿病性心肌病心功能变化特征

引 言

研究目的

材料和方法

结 果

结 论

讨 论

第二部分 实验兔糖尿病性心肌病心脏舒张功能不全时室壁被动僵硬度相关因素变化

引 言

研究目的

材料和方法

结 果

结论

讨论

第三部分坎地沙坦酯对糖尿病兔心脏舒张功能不全的影响

引 言

研究目的

材料和方法

结 果

结论

讨 论

本研究的创新性和局限性及展望

参考文献

附录

在读期间发表论文

致谢