沉默RANK对小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化及活化的影响

摘要

人工关节假体置换是对关节炎或肿瘤等疾病造成关节破坏而进行重建的最有效方法，但随着假体使用年限的延长，无菌性松动成为最主要的并发症，松动的发生和发展主要为假体活动所产生磨损颗粒介导的破骨细胞骨溶解所致。
　　 已有研究证实磨损颗粒作用下产生的各种炎症因子最终是通过核激活因子受体配体(ligand of receptor activator of NF-κB，RANKL)/核激活因子受体(receptor activator of NF-κB，RANK)/骨保护素(osteoprotegerin,OPG)信号传导系统和RANK信号通路来增强破骨细胞的分化与活化，最终导致假体周围骨溶解。RANK在此两种系统的中心作用，已被认为是破骨细胞分化与活化的最重要的信号受体。
　　 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是在转录水平上的基因阻断技术，由于其可以简单、有效、特异地下调细胞中靶基因表达，因此是研究基因功能的一种有力工具。本研究中利用RNA干扰技术特异性地抑制RANK表达，观察对小鼠骨髓巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage,BMM)向破骨细胞分化与活化的抑制作用，以期为人工关节假体无菌性松动提供新的治疗方法。
　　 本实验共分二部分进行研究：
　　 第一部分：小鼠BMM和破骨细胞的体外培养、鉴定及RANK表达情况
　　 目的：探讨利用骨髓诱导法获得小鼠BMM和破骨细胞的培养方法及所获细胞RANK的表达情况。方法：取BALB/c小鼠骨髓细胞，用100ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)诱导3天，获得贴壁细胞，流式细胞仪测定F4/80、CD11b表面抗原以确定培养细胞类型；将小鼠BMM用100ng/mL RANKL和30ng/mL M-CSF诱导6天，利用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色及甲苯胺蓝染色方法观察破骨细胞的形成及骨溶解情况,RT-PCR及Wstern blot分析小鼠BMM和破骨细胞RANK基因和蛋白表达情况。结果：BMM呈CD11b、F4/80阳性，阳性细胞比例可达到95％；培养第6天，抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞显著增多，甲苯胺蓝染色显示破骨细胞吞噬处被染成深蓝色。RT-PCR及Wstern blot显示RANK在此两种细胞上均有表达。结论：用骨髓诱导培养法可成功培养小鼠BMM和破骨细胞；培养出的细胞均有RANK表达。
　　 第二部分：沉默RANK基因对小鼠BMM向破骨细胞分化及活化的影响
　　 目的：探讨沉默RANK基因对小鼠BMM向破骨细胞分化及活化的影响。方法：设计并合成针对RANK基因的3条短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)，筛选出沉默RANK的最佳干扰序列；将构建含有最佳干扰序列的表达载体pSUPER-retro-pruo与包装质粒PIK共转染到293FT包装细胞，获得病毒液，并反复感染小鼠BMM，利用嘌呤霉素(Puromycin)筛选出嘌呤霉素抗性克隆的小鼠BMM；利用Western blot检测嘌呤霉素抗性克隆的小鼠BMM RANK蛋白表达情况；对病毒感染的小鼠BMM和未经感染的小鼠BMM分别用100ng/mL RANKL和30ng/mL M-CSF诱导，9天后TRAP染色及扫描电镜观察破骨细胞形成及骨溶解情况。结果：在3对干扰序列中，pshRANK-3抑制效果最为明显，可达到88.3％，(p＜0.01)；对经病毒感染的细胞进行RANK蛋白检测发现，RANK表达较未感染BMM RANK下降了80.7％，(p＜0.01)；与未感染BMM相比较，感染BMM在培养9天后，TRAP染色发现核≥3个的破骨细胞数量明显减少(分别为82±4.64，6.8±1.64，p＜0.05)；扫描电镜的结果显示骨陷窝面积明显减小(分别为16.6％±2.70％，2.8％±0.84％，p＜0.05)。结论：沉默RANK抑制小鼠BMM向破骨细胞的分化及活化。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分 小鼠骨髓巨噬细胞和破骨细胞的体外培养、鉴定及RANK的表达情况

1.1研究目的

1.2实验材料

1.3实验方法与步骤

1.4结果

1.5讨论

1.6结论

附图

第二部分 沉默RANK对小鼠BMM向破骨细胞分化及活化的影响

2.1研究目的

2.2实验材料

2.3实验方法及步骤

2.4实验结果

2.5讨论

2.6结论

附图

全文结论

参考文献

附录

致谢