藤黄酸通过调节PDGF受体β酪氨酸磷酸化及Rac1活性抑制大鼠主动脉平滑肌细胞的增殖与迁移

摘要

血管平滑肌细胞异常的增殖和迁移在动脉硬化和血管损伤后再狭窄中起着重要的作用。而PDGF(platelet derived growth factor，血小板衍生生长因子)是已知重要的血管平滑肌细胞异常增殖与迁移的刺激因子。较多的证据显示PDGF-BB和PDGF受体β介导的信号通路在血管重塑和血管损伤后新生内膜形成中起着极其重要的作用。因此，在病变形成过程中，它常被作为一个药物治疗战略的靶点。PDGFR的激活与一系列酪氨酸同源区2相关的蛋白有关，包括：RasGAP，磷脂酰肌醇(-3)激酶(P13K)和磷脂酶C(PLC)γ1，这些分子又进一步诱导特异性信号级联反应，激活PDGFR下游信号ERK，AKT，JNK和小分子蛋白rho及Rac1，这些信号参与了PDGF诱导的细胞反应：增殖和迁移。
　　 Rac1属于Rho GTP酶家族，既往报道Rac1活化在肿瘤的发生、侵袭和转移、细胞周期调控及凋亡过程中发挥着重要作用。除此之外，在一些细胞系中PDGF-BB可通过激活G-蛋白：Rac1和Cdc42，并在在其增殖和运动起着重要的作用。β-catenin是一种细胞骨架蛋白，由位于染色体3p21-22的ctnnb1基因编码。当受到细胞因子激活后，β-catenin进入细胞核内，激活转录因子引起细胞的增殖，已有报道在血管平滑肌细胞的增殖中起着重要的作用。β-catenin入核受经典的wnt激活，也受JNK、AKT、E-cadherin等分子的调控。Wu等的文章表明Rac1和JNK活化能促进β-catenin进入细胞核并调控细胞的增殖和胚胎肢体的长出。PDGF-BB能诱导β-catenin进入血管平滑细胞核并促进其增殖与迁移，但Rac1活化是否在PDGF-BB诱导的β-catenin核内聚集中起着重要的调控作用却不清楚。
　　 藤黄树产自中国及东南亚地区，中医药文献报道藤黄树脂具有较强的止血、抗炎、抗氧化和抗感染作用。藤黄酸是(Gambogic Acid，GA)藤黄树脂中提取的有效成分，既往的研究报道GA可通过抑制AKT，ERK，c-Src，FAK和VEGFR2等起到较强的抗癌、抗炎和抑制血管新生的作用。但GA是否能抑制PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移以及其内在的分子机制尚未可知。
　　 本研究发现：Rac1与JNK相互作用在PDGF-BB诱导的β-catenin核内聚集中起着重要调节作用，而GA通过影响PDGFR酪氨酸磷酸化及Rac1活性抑制了大鼠主动脉平滑肌细胞的增殖与迁移。本研究分2部分，现摘要如下：
　　 第一部分：
　　 PDGF-BB激活Rac1调控大鼠主动脉平滑肌细胞β-catenin的核内外分布
　　 目的：既往的研究基础提示JNK和Rac1可能在PDGF-BB刺激引起的β-catenin入核中可能起着关键的调控作用。因此本研究观察了JNK与Rac1的相互作用及其在PDGF-BB诱导β-catenin核内外分布和细胞增殖及迁移的作用。
　　 方法：(1)取SD大鼠胸主动脉贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞，并依靠细胞的形态和免疫组织化学方法对细胞进行鉴定。(2)设计大鼠Rac1siRNA三对，western法筛选，最有效者应用于实验。(3)CCK8试剂盒和Transwell小室分别检测不同浓度Rac1抑制剂NSC23766(25、50、100μmol/L)和Rac1siRNA(50nmol/L)对PDGF-BB(50μg/L)诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响。(4)为确定PDGF-BB对Rac1活性、pi-JNK表达和β-catenin核内聚集的时间特性，PDGF-BB刺激后在多个时间点检测上述指标的变化，分别于PDGF-BB刺激0、1、5、15、30、60min后应用GST-pulldown法检测Rac1活性，0、5、15、30、60、120min应用western blotting检测pi-JNK的表达，0、15、30、60、120、240min提取胞浆-胞核蛋白western blotting检测β-catenin核内表达。(5)为检测Rac1活化对PDGF-BB诱导的β-catenin的核内聚集和pi-JNK的影响。血管平滑肌细胞给予NSC23766和Rac1siRNA处理后，予以PDGF-BB刺激相应时间，检测Rac1活性受到抑制后PDGF-BB诱导的β-catenin的核内聚集和pi-JNK表达的变化。(6)为检测JNK的磷酸化是否对PDGF-BB诱导的β-catenin的核内聚集和Rac1活化也有作用，血管平滑肌细胞给予SP600125处理后，予以PDGF-BB刺激相应时间，检测JNK磷酸化受到抑制后PDGF-BB诱导的β-catenin的核内聚集和Rac1活性表达的变化。(7)为进一步证实Rac1和JNK活化对PDGF-BB诱导β-catenin核内聚集的影响，血管平滑肌细胞予以NSC23766、Rac1siRNA和SP600125处理后，PDGF-BB刺激1h后免疫荧光检测β-catenin的核内外分布变化。
　　 结论：Rac1活化与JNK的磷酸化之间存在相互作用，并在PDGF-BB诱导血管平滑细胞β-catenin核内聚集中起着关键的调节作用，抑制Rac1活化能显著抑制PDGF-BB诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞的增殖和迁移。
　　 第二部分：
　　 藤黄酸通过调节PDGFR酪氨酸磷酸化及Rac1活性抑制大鼠主动脉平滑肌细胞的增殖与迁移
　　 目的：藤黄酸是(Gambogic Acid，GA)藤黄树脂中提取的有效成分，既往的研究报道GA可通过抑制AKT，ERK，c-Src，FAK和VEGFR2等起到较强的抗癌、抗炎和抑制血管新生的作用。但GA是否能抑制PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移以及其内在的分子机制尚未可知。本实验对GA是否影响了PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移，以及其对增殖与迁移产生抑制作用的内在分子分子机制进行了研究。
　　 方法：(1)MTT法和[3H]-胸腺嘧啶掺入法检测了不同浓度GA(0.25μmol/L，0.5μmol/L，1.0μmol/L，2.0μmol/L)对PDGF-BB和EGF诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响。(2)流式细胞仪检测不同浓度GA对PDGF-BB和EGF诱导的细胞周期转换的影响。(3)PI/Annexin荧光双染流式细胞仪检测GA是否造成了细胞的死亡或凋亡。(4)Transwell小室检测了不同浓度GA(0.25μmol/L，0.5μmol/L，1.0μmol/L，2.0μmol/L)对PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞迁移的影响。(5)Western blotting检测了不同浓度GA对EGF诱导的EGFR、PDGF-BB诱导的PDGFR及其下游信号PLCγ1，ERK，AKT，JNK活化的影响，以及对细胞周期调节蛋白(cyclinD1，cyclinE，CDK2和CDK4)的影响。(5)GST-pulldown法检测不同浓度GA对PDGF-BB诱导的Rac1活化的影响。(6)为进一步检测GA作用的分子机制，酪氨酸活性检测(酪氨酸磷酸化表达)和斑点结合实验被应用于实验，以检测GA是否造成PDGF-BB和EGF诱导的酪氨酸磷酸化障碍以及GA是否在体外与PDGF-BB和EGF结合进而影响了其活性。
　　 结论：GA通过对PDGFR及其下游信号蛋白(ERK1/2、PLCγ1、AKT及JNK)的磷酸化和Rac1活性的抑制，并影响了细胞周期调节蛋白的表达，进而抑制了PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞的增殖与迁移。而这种抑制可能是通过直接抑制酪氨酸磷酸化引起的，而不是通过GA与PDGF-BB结合引起的。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分：PDGF-BB激活Rac1调控大鼠主动脉平滑肌细胞β-catenin的核内外分布

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分：藤黄酸通过调节PDGF受体β酪氨酸磷酸化及Rac1活性抑制大鼠主动脉平滑肌细胞的增殖和迁移

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附录

致 谢