调控辣椒素生物合成的主要转录因子筛选及功能验证

摘要

辣椒素只有在辣椒属植物中才能合成，并且辣椒素应用广泛。通过对辣椒素的不断研究，辣椒素的生物合成途径已基本阐明，但是对辣椒素合成途径的调控机制却鲜有报道。本研究根据辣椒基因组数据及生物信息学方法筛选5个辣椒转录因子（AP2/ERF和WRKY），利用VIGS、qRT-PCR、酵母单杂交等技术对它们进行功能鉴定，期望找出具有不同辣度的品种间在这些转录因子上的差异，为挖掘“涮涮辣”高辣椒素基因奠定基础。得到的研究结果如下：
　　(1) PCR初步检测得到了29株转CaAT3过表达的T0代转基因番茄。转化体的进一步鉴定正在进行。
　　(2)不同辣度的辣椒品种的启动子序列比对结果如下：辣椒素合成途径中结构基因AT3的启动子中，?59?（中辣品种）和?WL?（微辣品种）只存在1个碱基的差异，?740?(辣椒素含量最高的品种)和?59?有较大差异；对?59?,?170?,?740?,?XN?（中辣品种）的pAMT启动子序列比较分析，发现?59?和?170?(甜椒品种,无辣椒素)只有1个碱基的差异，?59?和?XN?有3个碱基的差异，?170?和?XN?有2个碱基差异，而?740?与其他3个品种的辣椒存在较大差异。对 COMT启动子序列的比对发现在?59?,?170?,?740?三个品种中只有?170?和其余两个品种相差4个碱基，?59?和?740?比对后COMT启动子序列是一致的。KAS启动子序列比对发现不同辣椒品种之间差异较大，其中?59?和?170?相差11个碱基，?59?和?740?相差21个碱基，?170?和?740?相差26个碱基。
　　(3)分离了“59”号辣椒的AT3,pAMT,COMT,KAS,PAL的启动子序列，并对它们进行了元件分析，发现这些基因的启动子序列都含有启动子核心元件及 ERF和 WRKY的识别序列。
　　(4)根据Kim等（2014）对辣椒基因组测序结果，经过生物信息学分析，初步筛选出5个ERF转录因子，并依次命名为CaERF1,CaERF2,CaERF3,CaERF4和CaERF5。根据Qin等（2014）对?Zunla-1?(Capsicum annuumL.)及其野生种?Chiltepin?(C. annuumvar. glabriusculum，also termedC. annuumvar. aviculare)的基因组测序结果，经生物信息学分析，初步筛选出参与辣椒素合成的WRKY家族的5个基因，依次命名为CaWRKY1,CaWRKY2,CaWRKY3,CaWRKY4和CaWRKY5。
　　(5)对?740?自交系辣椒中转录因子ERF家族和WRKY家族的各5个基因进行表达分析，发现 CaERF2和 CaERF5在胎座中的表达量显著高于果肉，而 CaERF3和CaERF4在果肉中的表达量都显著高于胎座。CaWRKY1，CaWRKY2在胎座中的表达量显著高于果肉，而 CaWRKY3在果肉中的表达量显著高于胎座。
　　(6)构建了上述10个转录因子的VIGS载体并进行了基因沉默处理，对辣椒ERF家族的5个基因分别进行沉默后，与CK相比，除CaERF3外，其余基因都在不同程度上得到了沉默。沉默后的CaERF1表达量约是CK的1/5，CaERF4和CaERF5的表达量约是CK的1/2，CaERF2沉默后的表达量和CK相近；与空载处理的PV2相比，沉默后CaERF1，CaERF4和CaERF5的表达量低于PV2，而CaERF2和CaERF3的表达量均高于PV2。与CK相比，AT3在沉默CaERF1,CaERF2，CaERF3后，表达量显著降低。经过VE1（沉默CaERF1）和VE2（沉默CaERF2）处理后，pAMT的表达量均低于CK，而沉默CaERF3,CaERF4,CaERF5后pAMT的表达量均比CK高，其中沉默CaERF3后pAMT的表达量最高。经过VE1、VE2、VE3（沉默CaERF3）处理后，FATA的表达量均高于CK，其中VE3处理的FATA的表达量是最高的。KAS的表达量只有在VE2处理下才低于CK，沉默CaERF1，CaERF3后，KAS表达量都高于CK。VIGS沉默WRKY家族的5个基因后效果不理想，没有进行后续分析。
　　(7) VIGS处理后对辣椒素进行测定的结果显示，与pTRV2相比，经VE1（沉默CaERF1）,VE2（沉默CaERF2）,VE3（沉默CaERF3）,VE5（沉默CaERF5）处理后，辣椒中辣椒素的含量均下降，其中VE1和VE3处理的辣椒素含量最低，处理VE4辣椒素的含量高于pTRV2。经过VIGS处理后，VE1,VE2,VE3,VE5处理的辣椒其二氢辣椒素含量均低于pTRV2，VE1处理的二氢辣椒素含量最低，VE4处理的二氢辣椒素含量高于pTRV2。
　　(8)经过在线软件BaCelLo对筛选出的辣椒ERF和WRKY家族的基因亚细胞定位预测后，结果显示筛选到的基因都定位于细胞核内。
　　(9)在线软件MEME分析转录因子的保守区域，CaERF1有两个AP2保守结构域，属于AP2蛋白。5个WRKY基因都含有两个保守区域属于第二类WRKY。
　　(10)酵母单杂交证明CaERF1,CaERF3,CaWRKY1,CaWRKY2能与CaAT3启动子结合。

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1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的意义与技术路线

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 转录数据生物信息学分析

3.2 “740”自交系辣椒的ERF和WRKY转录因子家族的表达分析

3.3 qRT-PCR分析辣椒VIGS处理后ERF和WRKY转录表达模式

3.4 VIGS处理后辣椒素含量的测定

3.5 转录因子的亚细胞定位预测分析

3.6 辣椒ERF和WRKY鉴定和分类

3.7 不同品种辣椒的启动子序列比对

3.8 启动子序列元件分析

3.9 酵母单杂交验证CaERF1、CaERF3、CaWRKY1、CaWRKY2和CaAT3启动子结合

3.10 转基因植株的获得

4 讨论

4.1 启动子序列比对及元件分析

4.2 转录因子对辣椒素合成的调控研究

4.3 转录因子生物信息学分析的应用

4.4 CaAT3的转化

5 结论

致谢

参考文献