越南篦齿苏铁(Cycas elongata)MADS-box基因克隆表达模式分析与内参基因筛选

摘要

MADS-box基因是真核生物中一类编码转录调控因子的基因家族，在植物花器官发育中起重要的调控作用，在过去二十多年中相关研究已取得较大进展，如著名的花发育ABCE模型，但关于花的起源却是未解之谜。裸子植物作为被子植物亲缘关系最近的类群，将成为研究花起源分子机制的重要切入点。裸子植物MADS-box基因的研究多集中在银杏、松柏类与买麻藤类中，苏铁类的相关研究却比较缺乏，因此我们利用越南篦齿苏铁（Cycas elongata）转录组数据挖掘获得12条MADS-box相似序列，并在8种不同组织中对12个基因进行空间表达模式的分析。获得的12条MADS-box基因，其中2条属于I型基因，10条属于MIKCC型基因。通过系统进化树构建将基因归到10个基因亚族中：AG、GGM13（Bsister）、AGL6、TM8、GGM4、GpMADS4、TM3、SVP、GGM19、GGM7和I型（Mβ+Mγ）。Type I型基因CeMADS11、12在营养器官与生殖器官中均有表达。MIKCC型基因中，CeMADS1、3、4三个基因在生殖器官中特异表达，CeMADS2以及CeMADS5-10共七个基因在生殖器官与营养器官中都有表达。除了GpMADS4亚族为裸子植物特有亚类外，其他亚族MADS-box基因的功能在种子植物进化过程中都相对保守。特别是花发育相关的B、C和E（AGL6-like）型同源基因，至少在3亿年前就已经存在于裸子植物与被子植物的共同祖先中，并且参与调控生殖器官的生长与发育。
　　荧光定量 PCR是研究基因表达量的重要技术手段，具有灵敏度高、实时性强、准确性上佳的特性，为了消除cDNA在合成过程中由于RNA本身纯度、产量、完整性和扩增酶效应以及 PCR扩增效率等因素带来的误差，需要选用稳定的内参基因对目标基因进行相对定量分析。基于本研究对MADS-box基因表达模式分析的需求，并且现在并无苏铁类内参基因相关报道的事实，本研究利用越南篦齿苏铁转录组数据，挖掘并鉴定了13个内参基因（ACT7、TUB、UBQ、EIF4、EF1、CLATHRIN1、PP2A、RPB2、GAPC2、TIP41、MAPK、SAMDC和 CYP），在越南篦齿苏铁8种不同组织器官中进行qRT-PCR，并使用NormFinder、GeNorm和 BestKeeper三个软件进行内参基因稳定性评估，最后获得最稳定的内参基因为GPAC2和RPB2，最不稳定的内参基因是ACT7。
　　据我们所知，这是首次在越南篦齿苏铁中克隆得到多个MADS-box基因并进行表达模式的分析，对裸子植物中苏铁类MADS-box基因数据的空缺进行了填补，为从分子层面解释花起源的机制提供了可能；同时这也是首次在越南篦齿苏铁中分离并筛选评估出稳定内参基因，为苏铁类植物分子生物学相关研究提供了重要参考。

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1 前言

1.1 被子植物花的起源

1.2 MADS-box基因与被子植物

1.3 MADS-box基因与裸子植物

1.4 种子植物MADS-box基因系统发育概述

1.5 MADS-box基因花起源假设

1.6 实时荧光定量PCR内参基因筛选

1.7 本研究目的意义

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 转录组数据目标基因挖掘

3.2 越南篦齿苏铁总RNA提取

3.3 目标基因引物设计、克隆与序列确定

3.4 MADS-box基因系统发育树构建

3.5 稳定内参基因筛选

3.6 MADS-box基因表达模式分析

4 讨论与结论

4.1 内参基因筛选

4.2 MADS-box基因

4.3 结论

致谢

参考文献

附录