DIN10、GHB和SKU5在拟南芥叶片花色素苷合成与降解过程中的作用

摘要

花色素苷（Anthocyanins）是植物中一类重要的的多酚类水溶性色素，由花色素苷配基与糖通过糖苷键结合而成。目前关于植物花色素苷的结构、生物合成途径、影响花色素苷合成的内外因子等的研究已十分详尽，但关于植物体内花色素苷降解机制的研究较少。植物的花、果实、叶片等部位在发育、成熟和衰老过程中存在普遍的花色素苷褪色降解现象。已有的研究表明，植物体内花色素苷降解并非其衰老的一部分，而可能与花色素苷-β-糖苷酶（Anthocyanin-β-glucosidase）和多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）、漆酶（Laccase）等有关。在植物中，除花色素苷-β-糖苷酶之外，其他的几个酶均有一定的研究。本文以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为材料，以两个糖苷酶基因GHB、DIN10和一个漆酶基因SKU5为对象，通过观察目的基因缺失的突变体植株、过表达目的基因植株的表型，结合目的基因在花色素苷降解过程中表达水平的变化，探讨了它们在拟南芥叶片花色素苷降解过程中的作用。
　　主要研究结果如下：
　　1.突变体的鉴定和评价
　　从拟南芥突变体数据库ABRC购买GHB、DIN10和SKU5基因的突变体，进行T-DNA插入位点分析，三个突变体皆是相对理想的T-DNA插入突变体。利用三引物法鉴定获得了突变体的纯合体。
　　2.蓝光诱导过程中和弱光恢复下花色素苷的含量变化
　　蓝光连续照射拟南芥突变体和WT幼苗3 d，叶片逐渐变紫色，积累部位主要集于在植株叶片背面和茎部。其中突变体叶片紫色程度比WT明显。3 d停止蓝光处理后移到昼夜交替（16 h光/8 h暗）的弱光下恢复时，紫色逐渐消失，5-7 d后紫色完全消失。分别测量7个取样点的幼苗花色素苷含量，结果与蓝光照射的表型一致。蓝光结束时，ghb花色素苷含量比WT多70-80％，sku5则比WT多75%左右，din10则是多40-50%。从恢复期花色素苷降解速率上看，突变体并没有比WT降解的慢，差异不明显。
　　3.蓝光诱导花色素苷合成过程中基因表达的变化
　　基因表达分析结果表明，不论是WT还是突变体拟南芥，与蓝光处理前相比，花色素苷合成关键基因（CHS、DFR、ANS和PAP1）都在蓝光照射期间表达都明显上调，而在蓝光结束后的恢复期间这些基因表达都有所降低。此外，糖苷酶基因 BGLU10、BGLU15、漆酶基因 SKU5的表达会有些许上调的现象，而过氧化物酶基因上调影响最为明显。在突变体拟南芥中，GHB的突变能增强花色素苷合成基因 ANS、DFR、CHS和 PAP1的表达而 DIN10和 SKU5基因的缺失对这些基因的表达影响不明显。DIN10、GHB和 SKU5这三个基因的单突变会一定程度上降低其他糖苷酶基因（BGLU15，DIN10，GHB）的表达。GHB的单突变能增强SKU5的表达，而DIN10影响不明显。GHB和DIN10两个基因突变均提高部分过氧化物酶基因（如PER38、PRX、PRX33和PRX34）的表达，而SKU5基因突变会降低过氧化物酶基因在蓝光照射期间的表达。
　　4.弱光恢复花色素苷降解过程中的基因表达变化
　　基因表达分析结果表明，野生型拟南芥中 BGLU15、DIN10和 GHB三个糖苷酶基因在花色素苷降解过程中有不同程度的上调，推测这些糖苷酶在降解花色素苷的过程中可能起一定的作用，它们可能是互相影响的：DIN10突变能非常明显的提高BGLU15的表达；GHB突变能明显提高DIN10的表达；而DIN10突变却使GHB的表达低于同时期的WT。在WT中，在恢复的1-5 d内，漆酶SKU5基因的表达逐渐上升，到了7 d转而下降。而如果GHB基因突变，漆酶SKU5基因的表达则会在5 d和7 d的时候明显上调。POD基因在野生型拟南芥花色素苷降解的过程中有十几倍甚至数十倍的提高，缺失糖苷酶或漆酶会使他们表达量在某些时间点增强到一百多倍，如din10中，PRX33和PRX34的表达在恢复1 d和7 d时上调100多倍。
　　5.酵母异源表达目的蛋白的活力及其底物专一性
　　GHB和DIN10蛋白都具有降解β-糖苷的活力，经不同底物的活力比较发现，这两个糖苷酶降解4-硝基苯β-D-吡喃葡萄糖苷的活力比4-硝基苯的其他糖苷强；此外，DIN10比GHB的β-糖苷酶活力强。
　　6. DIN10和GHB糖苷酶基因在拟南芥中过表达
　　通过Gateway技术构建过表达载体，通过农杆菌浸染转化拟南芥后经抗性板筛选、PCR鉴定后得到T3代植株，T3代植株经定量PCR分析基因表达，转DIN10植株获得2个株系，其DIN10基因表达比野生型高20-30倍。
　　本文的主要结论是：
　　持续的蓝光处理诱导拟南芥叶片花色素苷的积累，转入昼夜交替弱光恢复后，花色素苷迅速降解。GHB、DIN10和SKU5等基因在花色素苷降解过程中表达上调，暗示这些基因可能在花色素苷降解过程中起一定的作用。这些基因的突变均促进拟南芥花色素苷的合成，本文首次发现糖苷酶 GHB基因突变能明显诱导花色素苷合成基因在蓝光诱导系统中的表达。三个基因的单突变对诱导后的花色素苷降解过程影响不明显，一定程度引起另两个基因及其他花色素苷降解相关基因的表达上调，说明花色素苷降解的体系具有复杂性，各基因存在相互回补的关系。GHB、DIN10和SKU5等基因在花色素苷降解过程中作用有待进一步的分析。

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本文缩略词及中英文对照

目录

1.前言

1.1花色素苷的结构和特性

1.2花色素苷的生物学功能

1.3影响花色素苷稳定存在的因素

1.4花色素苷的合成途径

1.5花色素苷生物合成的调控

1.6花色素苷的体内降解机制

1.7 GATEWAY技术概述

1.8本课题的研究重点

1.9本研究课题的特色与新颖之处

2 材料与方法

2.1 材料与处理

2.2拟南芥基因组DNA快速提取

2.3拟南芥总RNA提取和质量检测

2.4 T-DNA突变体纯合体的鉴定

2.5花色素苷含量测定方法

2.6荧光定量PCR检测基因表达

2.7构建过表达载体

2.8 电击转化农杆菌

2.9农杆菌浸花法转化拟南芥

2.10 酵母真核表达

2.11 β-糖苷酶活力测定

3结果与分析

3.1基因的筛选

3.2拟南芥纯合突变体的获得和鉴定

3.3蓝光处理对拟南芥突变体表型以及基因表达的影响

3.4 GHB和DIN10过表达载体的构建

3.5过表达植株的获得

3.6酵母异源表达目的基因蛋白

4讨论

4.1 GHB，DIN10和SKU5的基本信息

4.2蓝光照射对拟南芥的影响

4.3突变体在蓝光诱导过程中与WT表型和基因表达差异

4.4突变体在弱光恢复过程中与WT表型和基因表达差异

4.5 GHB和DIN10都具有β-糖苷酶活力

4.6 DIN10和GHB糖苷酶基因在拟南芥中过表达

5. 结论

致谢

参考文献

附录A 拟南芥相关基因qPCR引物标准曲线

附录B 拟南芥相关基因qPCR引物扩增效率

附录C 拟南芥DIN10，GHB，SKU5基因ORF全长序列