VFM信号——一种来自Dickeya dadantii的新型群体感应信号的分离及性质探讨

摘要

Dickeya dadantii，原名Erwinia chrysanthemi3937，是一种常见的欧文氏菌属的植物病原细菌，其为兼性厌氧的革兰氏阴性菌，能在适合的环境下入侵植物的根、茎、叶、花、果实等器官的木质部，其主要表症是引起植物的“软根”、“褐变”等。该病原菌可在植物的各个生长周期入侵植物，其宿主植物范围广，并不断地在扩大，其中最常见的，包括有块根的植物如马铃薯、蔬菜与水果如菜椒与番茄，及一些具有经济价值的园艺作物等。
　　目前报道的Dickeya dadantii的毒力因子主要包括能致使植物细胞壁裂解的胞外酶类（包括一系列的果胶酶、一个纤维素酶及四个蛋白酶等）、脂多糖、胞外多糖、生物膜、铁载体、运动性、及hrpⅢ型分泌系统等，其中植物“软腐”病症是由胞外酶引发的。
　　William Nasser（2013）等研究发现，Dickeya dadantii入侵植物时存在一个潜伏期，在细菌浓度达到一定阀值时，会引起植物病害表症的大规模出现，他们怀疑该菌的扩繁与入侵受群体感应信号影响，并以野生型病原菌的胞外酶为表型，通过Tn5插入获得了两个表型缺失可被上清液互补回来的突变体，并首次发现了一段25kb的毒力因子调控基因簇（vfm基因簇），该基因簇中含有VFM合成和调控基因，可以调控胞外酶及VFM信号的生成。但vfm基因簇产生的群体感应信号分子的结构却不明确。
　　应William Nasser博士团队的邀请，作者所在实验室与其就Vfm群体感应信号的分离鉴定进行合作研究。本文使用在调控VFM信号合成及胞外酶表达的基因vfmE的启动子后插入uidA-Km基因簇做成的报告菌株A5243，测试VFM信号分子的活性。通过乙酸乙酯及正丁醇萃取的实验确定了VFM信号分子的极性。并使用乙醇浸提，MCI小孔树脂及凝胶分离的方法，获得VFM信号分子的粗提物。然后用正相硅胶细分离，获得相对较纯的信号分子，为进一步使用hPLC纯化和用MS及NMR鉴定出信号分子结构奠定了基础。
　　同时，本研究揭示了一些VFM信号物理及化学的特性，如通过乙酸乙酯与正丁醇萃取的实验发现，VFM信号分子不能被乙酸乙酯萃取却能被正丁醇萃取出来，确定了VFM信号为大极性物质。再如通过不同pH，高温处理后，VFM化学性质仍然稳定，且其长时间放置后化学性质稳定，由此得知VFM信号的化学性质相对稳定。另外不同试剂及蛋白酶K处理VFM信号的实验结果表明，VFM信号被饱和EDTA溶液、甲醇及蛋白酶K处理后仍然稳定，但其能与丙酮反应。
　　本文对VFM信号的分离及其理化性质进行了研究探讨，为VFM信号分子的纯化及结构鉴定打下了良好的基础。若VFM信号结构得以确定，不仅对Erwinia属的植物致病菌中发现新的群体感应信号有指导意义，并有可能发现新的植物致病调控机制，同时，对细菌的进化进程的研究也可以提供很好的借鉴。

目录

声明

缩写词和英汉对照表

1前言

1.1 Dickeya dadantii 病害概况

1.2 D. dadantii的致病机理

1.3 D. dadantii中群体感应（QS）系统

1.3 本研究的内容、目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料及仪器设备

2.2 D. dadantii野生型菌株及报告菌株的保存、复壮与复苏

2.3 VFM信号的性质确定

2.4 VFM信号的检测

2.5 D. dadantii 的发酵

2.6 VFM信号粗分离除杂填柱材料的选择及方法探索

2.7 VFM信号的hPLC分离

3 结果与分析

3.1 D. dadantii野生型菌株及报告菌株的保存、复壮

3.2 VFM信号性质的确定

3.3 VFM信号的检测

3.4 D. dadantii 的发酵

3.5 VFM信号粗提物分离前处理、分离方法及条件的摸索

3.6 VFM信号的分离

4 结论与讨论

4.1 结论

4.2 讨论

致谢

参考文献

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附 录 G

附 录 H

附 录 I

附 录 J