人乳头瘤病毒11型全基因组转基因小鼠基因元件的设计与构建

摘要

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）11型是人尖锐湿疣（condyloma acuminatum，CA）的主要病原体之一。目前还没有根治CA的有效手段，并且对其致病机理至今都还不太了解。一种理想的动物病理模型对致病机理的体内研究和治疗手段的临床前评价都有重要意义。本课题的内容就是设计并在质粒上构建HPV11全基因组转基因小鼠模型的外源基因。 HPV11在宿主体内表达出病理蛋白的一个重要前提是其基因组必须保持游离状态，加之该基因对上皮细胞的专嗜性，因此HPV11转基因动物的外源基因除了应含有HPV11完整基因组外，还要包含能够在转基因鼠的上皮细胞，将HPV11切割下来的基因元件。 本课题首先根据HPV11的致病特点，结合成熟的Cre/LoxP可控表达技术设计转基因的外源基因及其功能元件。主要思路是将完整开放读码框的HPV11基因组以3'—5'的顺序置于正向连接的两组LoxP序列中间，LoxP序列两端分别连接真核细胞启动子和EGFP序列，当出现由上皮细胞启动子启动的Cre酶表达时，可使LoxP中间的HPV11基因组被切下，实现在小鼠体内游离的自然致病状态，同时LoxP残基将启动子和EGFP序列相连接，出现荧光。 实验第一部分为质粒构建。 本实验室保存有含HPV11全序列的质粒pBR322/HPV11，并获得了一个适合于构建HPV11两端功能序列的质粒pQE—Trisystem。质粒构建过程包括三个小部分。 第一部分，首先将HPV11全基因组从pBR322/HPV11中切下，同时酶切质粒pQE—Trisystem，并对回收产物去磷酸化。将回收的HPV11和去磷酸化后的pQE—Trisystem连接，连接产物转化DH5a，做菌落PCR实验以筛选出反向连接阳性克隆，得到的产物命名为质粒A。 第二部分，首先从质粒pIRE2—EGFP中扩增出LoxP—EGFP—PolyA序列，扩增同时加上酶切位点，接着对扩增产物和质粒A进行酶切，回收酶切产物。然后将两个回收产物相连接，得到的产物命名为质粒B。 第三部分，从pBR322/HPV11中扩增出LoxP—7931—7072序列，加上酶切位点，酶切PCR产物和质粒B并回收。将两个回收产物连接，转化DH5a，做菌落PCR实验以筛选出反向连接阳性克隆，得到质粒构建最终产物，命名为质粒C。 实验第二部分对构建的序列的功能进行了初步的体外检测。 首先从儿童包皮中分离出人皮肤角质形成细胞（keratinocytes）。在传到第二代时，用脂质体法将质粒C和表达Cre酶的质粒pIC—Cre共转染角质形成细胞，并设对照组，观察荧光蛋白表达情况，最后RT—PCR检测HPV11早期基因E6的转录水平。 研究结果： 1．用核酸凝胶电泳和测序的方法验证所构建的质粒C与实验设计的相符。 2．转染入角质形成细胞后实验组观察到荧光表达。 3．RT—PCR检测HPV11E6在转录水平上的表达为阳性。 4．转染的角质形成细胞和对照组的角质形成细胞相比，传代次数增加了3倍。 结论： 体外初步检验表明，构建的序列保留了野生型HPV11的致病特点，并且Cre/LoxP系统能够在细胞内将HPV11切割为游离状态，同时使荧光蛋白有效表达。因此，在质粒C上的这段序列具备了制作HPV11转基因小鼠病理模型的潜力。

目录

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声明

第一章文献综述

1.1人乳头瘤病毒简述

1.2转基因技术研究进展

1.2.1.转入基因的长度问题

1.2.2构建多转基因动物的策略

1.2.3引入DNA的位点

1.2.4转入基因的整合

1.2.5转基因的表达

1.3 HPV转基因动物病理模型

1.3.1 HPV病毒基因功能

1.3.2全基因组HPV转基因动物

1.3.3利用病毒自身调控元件启动HPV致癌基因的转基因研究

1.3.4利用异源性启动子启动HPV致癌基因的转基因研究

第二章绪论

2.1研究的目的与意义

2.2研究内容和预期结果

第三章实验材料与方法

3.1转入基因的构建

3.1.1实验材料

3.1.2溶液配制

3.1.3实验方法

3.2 体外检测

3.2.1实验材料

3.2.2溶液配置

3.2.3实验方法

第四章研究结果与分析

4.1转入基因的构建

4.1.1质粒A的构建

4.1.2质粒B的构建

4.1.3质粒C的构建

4.2体外检测部分

4.2.1原代角质形成细胞的分离培养

4.2.2荧光显微镜观察EGFP的表达

4.2.3 RT-PCR检测目的基因在转录水平表达的结果

第五章讨论

5.1.质粒构建

5.1.1构建思路

5.1.2构建序列的特点

5.1.3 Cre/LoxP系统和hk-14在本实验中的创新性运用

5.2对目的基因的体外检测

5.3需继续完成的后续实验

5.4结论

参考文献

附录

致谢

在学期间所发表的文章