烟草叶片蔗糖酶的分离纯化及部分性质研究

摘要

蔗糖酶(EC，3.1.2.26)是一种水解酶，广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。蔗糖酶在高等植物物质的贮存和光合作用产物的运输中起重要的作用。它不可逆的催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖，为植物的生长和发育提供碳源和能源。蔗糖酶在蔗糖由源组织向库组织的运输中也具有重要的作用，蔗糖酶被认为是植物体内碳水化合物代谢中的关键酶。而且蔗糖酶还可以参与植物体的细胞分化和膨大、信号传导、以及对机械损伤、病菌侵害和对各种胁迫的响应等方面。 烟草属双子叶植物纲(Dicotyledoneae)、管花目(Tubiflorae)、茄科(Solanaceae)、烟草属(Mcotiana)。是收获叶片的作物。烤烟是西南地区乃至全国重要的经济作物之一，我国卷烟工业生产中的重要材料来源。伴随着吸烟与健康的问题，烟草产品的质量控制在过去的儿年中，成了全球日益关注的话题。 糖作为一个必要的成分存在于所有的烟草品种之中，糖类的特征和品质不仅强烈的影响着作为卷烟生产中原材料烟叶的质量品质。而且还会影响最终的卷烟工业产品质量。糖不仅作为烟草中的一个天然组成成分，并且也经常被用来添加到卷烟生产中，被认为是一种安全的卷烟产品生产香味剂和保湿添加剂。蔗糖、果糖、葡萄糖等糖类是有机酸、类胡萝卜素和其它营养成分及芳香物质合成的基础原料。而且研究表明存在于烟草中的这些化合物的含量在烟叶的质量分级中具有很重要的作用。 本实验主要通过对烟草叶片蔗糖酶的分离纯化、理化性质、酶促动力学特性以及功能基团的化学修饰等方面进行了研究，以期能够为在烟草栽培、烟叶生产及卷烟加工过程提供相应的理论基础，结果如下： 1．蔗糖酶的分离纯化以烟草叶片为材料通过组织捣碎、缓冲液抽提、超滤，硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析。以SDS-PAGE检测其纯度，获得了电泳纯的烟草叶片蔗糖酶。纯化倍数为138倍，比活性为65 U/mg, 同收率为17.4％。 2．蔗糖酶的性质研究结果表明，蔗糖酶全分子量为129Kd。亚基分子量为63.5Kd．表明蔗糖酶是由两个相同的亚基组成。酶促动力学性质研究表明，蔗糖酶的最适pH值为4.0.在pH 3.0～5.5的范同内比较稳定，最适温度为45℃，温度高于 55℃以上不稳定．酶的特征米氏常数Km值为13mmol/L．最大反应速度Vmax为7.67μg/min。 3．金属离子及EDTA的影响在实验中，Hg<'2->、Pb<'2->、Ag<'->及EDTA对蔗糖酶的抑制能力最强。而Cr<'3->、As<'5->对蔗糖酶的活性也有一定的抑制作用，Mn<'2->、Cu<'2->则能促进酶的活性。Mg<'2->、K<'->对蔗糖酶的活性无影响。 4．蔗糖酶的化学修饰采用 PMSF、NBS、IAc、 BrAc、SUAN、TNBS、PCMB、DTT等修饰剂在一定的条件下修饰蔗糖酶，表明：PMSF、NBS、PCMB等显著地抑制酶的活力，而BrAc、IAc、TNBS、SUAN、DTT等对酶的活力影响不大。

目录

文摘

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第一部分文献综述

第二部分引言

2.1研究的选题依据

2.2研究的技术路线

2.3研究的主要内容

2.3.1蔗糖酶的分离纯化

2.3.2理化性质、动力学研究

2.3.3金属离子对酶的影响

2.3.4功能基团研究

第三部分蔗糖酶的分离纯化及性质研究

3.1实验材料

3.1.1材料来源

3.1.2主要试剂

3.1.3主要设备

3.1.4试剂配制

3.2实验方法

3.2.1酶活性的测定

3.2.2蛋白质浓度的测定

3.3酶的分离纯化

3.3.1粗酶液的制备

3.3.2硫酸铵分级沉淀

3.3.3 DEAE-Sepharose层析

3.3.4 Sephacryl S-200凝胶过滤层析

3.4蔗糖酶纯度鉴定

3.5酶的理化性质

3.5.1蔗糖酶分子量的测定

3.6酶促动力学研究

3.6.1最适pH值的测定

3.6.2 pH稳定性的测定

3.6.3最适温度的测定

3.6.4热稳定性的测定

3.6.5蔗糖酶Km及Vmax的测定

3.7金属离子对蔗糖酶的影响

3.8实验结果与分析

3.8.1蔗糖酶的分离纯化

3.8.2蔗糖酶纯度鉴定

3.8.3蔗糖酶理化性质研究

3.8.4酶促反应动力学研究

3.8.5金属离子对酶活性的影响

第四部分蔗糖酶功能基团的研究

4.1材料与方法

4.1.1实验材料

4.1.2实验试剂

4.1.3试剂配制

4.1.4实验方法

4.2实验结果与分析

4.2.1丝氨酸残基的化学修饰

4.2.2色氨酸残基的化学修饰

4.2.3组氨酸残基的化学修饰

4.2.4赖氨酸残基的化学修饰

4.2.5巯基的化学修饰

4.2.6硫键的化学修饰

第五部分讨论

5.1蔗糖酶的分离纯化

5.2蔗糖酶的理化性质

5.3蔗糖酶的酶学性质

5.4金属离子的影响

5.5功能基团的修饰

5.6展望

参考文献

致谢