灵芝三萜和灵芝多糖对小鼠急性肺损伤干预作用的比较研究

摘要

灵芝是我国具有悠久历史的药食兼用真菌，具有补气安神，止咳平喘，延年益寿的功效。灵芝中含有多糖类、氨基酸类、三萜类、生物碱类等化合物，其中多糖和三萜类化合物是主要的两类活性物质。本研究采用醇提萃取和水提醇沉等方法提取分离出灵芝三萜类化合物和灵芝多糖，结合化学和波谱学方法分析了两类活性物质的化学成分;利用腹腔注射LPS构建小鼠急性肺损伤模型，通过计数肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数，测定肺组织、血清、BALF中的TNF-α、IL-1β含量和肺组织中MPO含量，以及western blotting和EMSA分析炎性信号通路的表达情况，对灵芝三萜类化合物和多糖干预肺损伤作用进行比较。以期进一步阐明灵芝中起到主要预防肺损伤的有效成分，为研究灵芝预防肺损伤提供理论依据。主要研究结果如下:
　　(1)通过醇提萃取、水提醇沉、severg法脱蛋白等方法分别获得灵芝三萜类化合物(GT)和灵芝多糖(GLP)这两类活性物质，利用高效液相、液质联用、红外光谱法、PMP衍生化、GC-MS等方法对活性物质进行分析，GT主要由ganoderic acid C2、ganoderic acid C6、ganoderic acid G、ganoderic acid B和ganoderic acid E等物质组成，与参考文献结果相符，GLP主要由葡萄糖和少量的甘露糖、半乳糖组成，甲基化分析显示糖苷键连接方式为1-linked D-Glcp、1，3-linked D-Glcp、1,4-linked D-Glcp、1,6-linked D-Glcp、1,2,6-linked D-Glcp、1,6-linked D-Galp、1,2,6-linked D-Galp和1,3,6-linked D-Manp。
　　(2)灵芝三萜类化合物和灵芝多糖对急性肺损伤小鼠炎性指标的干预作用比较:腹腔注射LPS致小鼠急性肺损伤后，小鼠体重明显降低，肺组织湿/干比和肺系数均显著升高，肺泡灌洗液(BALF)中的细胞总数明显增加，肺组织中的髓过氧化物酶(MPO)含量升高，此外，肺组织结构遭到破坏，大量炎性细胞浸润肺组织，支气管收缩，肺泡壁毛细血管扩张充血，CD68阳性巨噬细胞在肺组织气管内聚集，表现出明显的肺损伤和肺气肿倾向。两类药物组均可有效抑制小鼠体重减轻和肺组织湿/干比及肺系数的升高，降低BALF中的细胞含量和肺组织中的MPO含量，缓解肺组织损伤程度，减少肺组织中炎性细胞的浸润及阳性巨噬细胞的聚集，且表现出一定的剂量依赖关系。同时GLP药物组的干预效果优于GT药物组，对急性肺损伤具有更好的保护作用。
　　(3)灵芝三萜类化合物和灵芝多糖对急性肺损伤小鼠炎性信号通路的干预作用比较小鼠急性肺损伤后，与正常组相比，肺组织、血清和BALF中的促炎因子TNF-α、IL-1β含量显著升高，上调肺组织中p-p38、p-ERK1/2、p-JNK、p-NFκBp65及IκB的蛋白表达水平及NF-κB和AP-1中的DNA结合活性。与模型组相比，两类药物组均可有效降低肺组织、血清和BALF中TNF-α、IL-1β含量，抑制MAPK和NF-κB炎性信号通路中特征性蛋白p-p38、p-ERK1/2、p-JNK、p-NFκBp65和IκB的表达，降低LPS致小鼠肺损伤中的NF-κB和AP-1中的DNA结合活性，并表现出一定的剂量依赖关系。同时GLP药物组的干预效果优于GT药物组，对急性肺损伤具有更好的保护作用。
　　综上所述，两类药物组均可缓解小鼠急性肺损伤，抑制炎性因子表达，调控炎性信号通路，干预肺部炎症的产生，且GLP干预效果优于GT。

目录

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致谢

摘要

缩写词简表

一 绪论

1．2 缓解ALI症状的方法

1．2．1 抗炎药物

1．2．2 一氧化氮

1．2．3 抗凝治疗

1．2．4 化疗

1．3 灵芝的研究概况

1．4 灵芝多糖

1．4．1 灵芝多糖的提取分离纯化

1．4．2 灵芝多糖药理活性

1．5 灵芝三萜

1．5．1 灵芝三萜的提取分离

1．5．2 灵芝三萜的药理活性

1．6 其他化学成分

1．7 灵芝应用

1．9．1 研究意义

1．9．2 研究内容

1．9．3 研究技术路线

二 材料与方法

2．4 实验方法

2．4．1 灵芝三萜类化合物的提取

2．4．2 灵芝多糖的提取

2．4．3 灵芝三萜类化合物结构特征

2．4．4 灵芝多糖结构特征

2．4．5 灵芝三萜类化合物和灵芝多糖对小鼠急性肺损伤预防作用的比较

2．5 数据处理

三 结果与分析

3．2 灵芝多糖的结构特征

3．2．1 红外波谱分析

3．2．2 PMP衍生化测定单糖组成

3．2．3 甲基化反应

3．3．1 小鼠体重变化

3．3．2 小鼠肺组织的湿／干重比及肺系数的变化

3．3．3 小鼠肺泡灌洗液中细胞总数的变化

3．3．4 小鼠肺组织中髓过氧化物酶(MPO)含量的变化

3．3．5 GLP药物组和GT药物组对小鼠血清、肺组织和肺泡灌洗液炎性因子含量的影响

3．3．6 肺组织病理学观察

3．3．7 小鼠肺组织巨噬细胞CD68的免疫组化

3．3．8 GLP药物组和GT药物组对小鼠肺组织炎性通路蛋白表达的影响

3．3．9 GLP药物组和GT药物组对小鼠肺组织NF-κB和AP-1信号通路活性的影响

四 讨论

五 结论

参考文献

攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况