免疫抑制剂对ZymosanA诱导小鼠RAW264.7细胞Dectin-1/TLR2信号通路的影响

摘要

目的：观察四种免疫抑制剂（地塞米松、环磷酰胺、环孢素A、霉酚酸酯）对酵母聚糖Zymosan A诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞Dectin-1/TLR2受体表达及TNF-α释放的影响，通过体外模拟真菌感染试验，从模式识别机制探讨不同免疫抑制剂对天然免疫系统识别真菌病原体环节的影响，进而进一步揭示不同免疫抑制剂与难控性真菌感染之间的关联及区别。
　　方法：1.体外培养RAW264.7巨噬细胞，给予100μg/ml Zymosan A对细胞进行干预刺激，分别采用RT-PCR技术和流式细胞术检测Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平的变化，ELISA检测炎症因子TNF-α的变化。2.分别给予不同剂量的地塞米松、环磷酰胺、环孢素A和霉酚酸酯处理细胞24h，CCK-8增殖毒性实验检测不同免疫抑制剂对细胞生长增殖的影响，选择合适的药物浓度进行后续试验。3.给予地塞米松、环磷酰胺、环孢素A、霉酚酸酯干预细胞24h，采用RT-PCR技术和流式细胞术检测Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平的变化。4.地塞米松、环磷酰胺、环孢素A、霉酚酸酯预处理RAW264.7细胞24h，再利用100μg/ml Zymosan A单独刺激细胞，RT-PCT和流式细胞术检测细胞Dectin-1/TLR2 mRNA和蛋白水平的变化，ELISA检测上清液中TNF-α浓度的变化。
　　结果：1. Dectin-1 mRNA的表达水平在Zymosan A作用2h后迅速升至高峰，随后开始逐渐下降，而TLR2 mRNA水平于2h时开始升高，4h升至峰值后开始逐渐下降；Zymosan A干预3h时，即可检测到细胞表面Dectin-1蛋白表达升高，6h后TLR2蛋白含量升高；TNF-α的浓度于2h即开始逐渐升高，12h升至最高，随后开始逐渐降低。2. CCK-8细胞增殖毒性实验结果显示：随着剂量的增加，地塞米松、环磷酰胺、环孢素A和霉酚酸酯干预24h后，均能不同程度地表现出对小鼠RAW264.7细胞增殖的抑制。3.地塞米松单独刺激细胞24h，Dectin-1 mRNA和蛋白水平均下降，TLR2 mRNA和蛋白水平升高；环磷酰胺对Dectin-1和TLR2的变达无明显影响；霉酚酸酯和环孢素A均能抑制Dectin-1和TLR2 mRNA和蛋白水平的表达。4.地塞米松预处理的细胞受到Zymosan A刺激后， Dectin-1、TLR2的mRNA和蛋白水平均降低，TNF-α的含量较Zymosan A单独刺激组无明显变化；环磷酰胺对Dectin-1和TLR2的表达无明显影响，但是能轻度提高TNF-α的释放；霉酚酸酯和环孢素A均能不同程度地抑制Zymosan A诱导的Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平的表达，减少细胞因子TNF-α的分泌。
　　结论：地塞米松主要通过抑制Zymosan A激活状态下Dectin-1和TLR2的转录和表达；霉酚酸酯和环孢素A主要通过抑制Zymosan A诱导巨噬细胞Dectin-1和TLR2的转录和翻译，同时降低炎性因子TNF-α的分泌；环磷酰胺对Zymosan A激活的Dectin-1/TLR2信号通路无影响，其引发难控性真菌感染的病理机制可能与此无关。

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1前言

2材料与方法

2.1 实验对象

2.2 主要试剂

2.3 实验仪器设备

2.4主要试剂的配制与灭菌

2.5 实验方法

2.6 统计学分析

3结果

3.1 Zymosan A对RAW264.7巨噬细胞Dectin-1、TLR2mRNA表达的影响

3.2 Zymosan A对RAW264.7巨噬细胞表面Dectin-1、TLR2蛋白表达的影响

3.3 Zymosan A对RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α的影响

3.4 不同种类和剂量免疫抑制剂对RAW264.7巨噬细胞细胞活性的影响

3.5 不同种类和剂量免疫抑制剂对RAW264.7巨噬细胞细胞形态学的影响

3.6 不同种类和剂量免疫抑制剂对细胞Dectin-1、TLR2 mRNA表达的影响

3.7 不同种类和剂量免疫抑制剂对RAW264.7巨噬细胞表面Dectin-1、TLR2蛋白表达的影响

3.8 不同种类和剂量免疫抑制剂对Zymosan A诱导RAW264.7巨噬细胞Dectin-1和TLR2 mRNA表达的影响

3.9 不同种类和剂量免疫抑制剂对Zymosan A诱导的细胞表面Dectin-1、TLR2蛋白表达的影响

3.10 不同种类和剂量免疫抑制剂对Zymosan A诱导细胞因子TNF-α释放的影响

4讨论

5结论

参考文献

附录

个人简历

教育背景

论文发表情况

致谢

综述:Dectin-1和TLR2对病原真菌的免疫识别