急性运动中心肌线粒体动力学变化对心肌炎症反应的影响

摘要

目的：本研究通过观察急性运动过程及其恢复期大鼠心肌线粒体功能及其融合、分裂相关蛋白的表达变化，分析心肌线粒体ROS生成与心肌炎症反应相关蛋白表达水平的关系，探讨急性运动中心肌线粒体动态变化对心肌炎症反应的影响及可能机制。
　　方法：雄性SD大鼠48只随机分为8组：分别是安静对照组（C）、运动45 min，90 min，120 min（分别用E45，E90，E120表示）、运动120 min后恢复12 h，24 h，36 h，48 h（分别用 R12，R24，R36，R48），各组均为6只。运动组及运动恢复组大鼠置于小动物跑台进行一次急性递增负荷的运动为实验模型，在各时间点取样分析以下指标：采用荧光标记JC-1测量线粒体膜电位；采用Oxygraph-2k呼吸测量仪测量线粒体态3、态4呼吸速率，计算呼吸控制比；采用荧光素-荧光素酶发光法测线粒体ATP酶合成活性；采用荧光标记DCFH-DA测量线粒体ROS生成速率；Western blot法测定心肌组织Mfn1/2，OPA1，Drp1，Fis1，NLRP3，IL-1β的蛋白含量。
　　结果：
　　1.心肌线粒体呼吸功能及ROS的生成速率：
　　1）与C组相比，E45组线粒体膜电位呈显著性升高(p<0.05)，E120组显著降低(p<0.05)。
　　2）与C组相比，在运动过程中，E45组线粒体ATP合成酶活性呈显著性升高(p<0.01)，E120组显著降低（p<0.05），在运动后恢复期，R24组线粒体ATP合成酶活性显著升高(p<0.05)。
　　3）与C组相比，在运动过程中，E45组线粒体态3，态4呼吸速率呈显著性升高(p<0.001，p<0.05)，同时伴随着线粒体呼吸控制比（Respiratory control ratio，RCR）显著升高(p<0.05)；E120组线粒体态3呼吸速率显著降低(p<0.01)，线粒体态4呼吸速率显著升高(p<0.05)，RCR显著性降低（p<0.01）；在运动后恢复期，R24组线粒体态3呼吸显著升高(p<0.05)，RCR显著升高(p<0.05)，其余各组均无显著性差异。
　　4）与C组相比，E45、E90和E120组线粒体ROS生成速率逐渐上升且有显著差异（p<0.05，p<0.001，p<0.001），一直延续到R12组（p<0.01）。
　　2.心肌线粒体动力学相关蛋白的表达：
　　1）与C组相比，E45、E90和E120组Mfn1蛋白表达逐渐下降且有显著差异（p<0.05，p<0.01，p<0.01），一直延续R12组（p<0.01）；Mfn2蛋白表达在E45、E90和E120组也逐渐下降且有显著差异（p<0.05，p<0.05，p<0.01），但R12和R24组Mfn2蛋白表达突然上升且有显著差异（p<0.01，p<0.01）；OPA1蛋白表达在E120组显著降低（p<0.05）并延续到R12组（p<0.05）。
　　2）与C组相比，E45、E90和E120组Drp1蛋白表达显著升高(p<0.01，p<0.05，p<0.05)。E45、E90和E120组Fis1蛋白表达显著高于C组(p<0.05，p<0.01，p<0.001)并延续到R12、R24和R36组（p<0.001，p<0.01，p<0.05）。
　　3.心肌炎症反应相关蛋白的表达：
　　与C组相比，NLRP3蛋白表达只有在R12组和R24组时才呈显著性升高（p<0.01，p<0.05）。IL-1β蛋白表达在E45组，R12组和R24组时呈显著性升高（p<0.05，p<0.001，p<0.01）。
　　结论：
　　本文以大鼠进行一次急性递增负荷运动为模型，观察了运动及恢复期这一连续的时间进程中，心肌线粒体ROS生成速率，融合分裂相关蛋白表达及炎症反应相关蛋白NLRP3，IL-1β表达的时序变化，结论如下：
　　1、运动早期心肌线粒体氧化磷酸化功能增强，晚期减弱，恢复期逐渐上升并恢复到正常水平。
　　2、运动中心肌线粒体ROS生成速率逐渐上升，恢复期逐渐恢复到正常水平。
　　3、运动中心肌线粒体动态变化表现为运动中融合趋势下降、分裂趋势增强，运动后逐渐反向恢复的动态变化特征。
　　4、运动后心肌炎性因子 NLRP3，IL-1β表达均显著升高，表明出现心肌炎症反应。
　　5、急性运动中心肌线粒体动力学改变可能会影响心肌的炎症反应。

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中文摘要

英文摘要

1 前言

2 实验材料及研究方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.2实验方法

2.2.1动物模型

2.2.2技术路线

2.2.3心肌样本采集

2.2.4 心肌线粒体提取

2.2.5 蛋白样品定量

2.2.6心肌线粒体膜电位测定

2.2.7心肌线粒体ATP合成活力测定

2.2.8 心肌线粒体呼吸功能测定

2.2.9 心肌线粒体ROS生成速率

2.2.10 western blotting法检测蛋白表达

2.3统计学处理

3．实验结果与分析

3.1急性运动及恢复期大鼠心肌线粒体呼吸功能水平及ROS生成速率

3.2急性运动及恢复期大鼠心肌线粒体动力学相关蛋白表达

3.2.1急性运动及恢复期大鼠心肌Mfn1蛋白表达

3.2.2急性运动及恢复期大鼠心肌Mfn2蛋白表达

3.2.3急性运动及恢复期大鼠心肌OPA1蛋白表达

3.2.4急性运动及恢复期大鼠心肌Drp1蛋白表达

3.2.5急性运动及恢复期大鼠心肌Fis1蛋白表达

3.3 急性运动及恢复期大鼠心肌炎性相关蛋白表达

3.3.1急性运动及恢复期大鼠心肌NLRP3蛋白表达

3.3.2急性运动及恢复期大鼠心肌IL-1β蛋白表达

3.4 大鼠心肌线粒体 ROS生成，融合分裂蛋白及炎症相关因子蛋白表达的相关性分析

4．讨论

4.1. 急性运动对线粒体呼吸功能和ROS生成的影响

4.2. 急性运动对线粒体动力学的影响

4.3. 急性运动心肌对炎症反应的影响

4.4. 线粒体动力学、ROS、炎症反应的关系

5 研究结论

6 本研究的不足及今后研究的考虑

参考文献

论文综述:线粒体动态变化与炎症反应

附录

致谢

研究生个人简介