亚低温对LPS介导的小胶质细胞TLR4/NF-kappaB信号通路的影响

摘要

脓毒症（Sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)。小胶质细胞（microglia,MG）是神经系统内的免疫细胞，主要表达TLR4受体，其TLR4都存在于细胞膜上，可特异地识别脂多糖，触发SIRS。亚低温在神经系统的各种疾病的治疗中已取得了明显的优势，并被列入2010年的美国心肺复苏指南。但亚低温对脓毒症病程中脑保护的机制尚不清楚。我们进行此项研究，以了解亚低温是否通过影响小胶质细胞的TLR4/NF-kappaB信号通路从而抑制炎症因子的释放，达到神经系统的保护作用。
　　目的：
　　了解亚低温治疗对内毒素（lipopolysaccharide,LPS）诱导的小胶质细胞的TLR4/NF-kappaB信号通路的转录与表达以及炎症因子释放的影响。
　　方法：
　　以LPS感染体外培养的小胶质细胞，将培养后的小胶质细胞分为四组：37℃-NS组(正常对照组)、37℃-LPS组、33℃-NS组和33℃-LPS组，于感染后的0h、2h、6h、12h和24h各时间点收集各组细胞和细胞培养上清，同时以不同温度下的未感染细胞作为正常对照组。
　　1.用TRIzol提取细胞中RNA,通过实时定量PCR检测小胶质细胞中TLR4、NF-κB mRNA转录水平。
　　2.用免疫印迹法（Western-blot）法检测各组细胞中TLR4、NF-κB蛋白的表达水平，
　　3.用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组细胞上清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素10（IL-10）的水平。
　　4.用MTT法检测各组细胞增殖情况。所得数据均经统计学软件分析。
　　结果：
　　1.37℃-LPS组：随着诱导时间的延长炎症因子TNF-α、IL-10的含量逐渐升高；在LPS介导的小胶质细胞的不同时间点，可上调TLR4、NF-κB基因转录水平表达，且其表达量均随时间的延长逐渐升高；且细胞中TLR4、NF-κB蛋白含量表达均与LPS刺激之间有时间依赖性关系；
　　2.33℃-LPS组：随着诱导时间的延长炎症因子TNF-α、IL-10的含量逐渐升高，但与常温LPS组相同时间点上清液中炎症因子的含量比较明显降低（TNF-?：2h:P<0.01；6h:P<0.01；12h:p<0.0001；24h:P<0.0001。IL-10：2h:P2<0.05；6h:P<0.005；12h:P<0.0001,24h:P<0.0001）；在细胞中的TLR4、NF-κB基因转录水平表达有所下降，有统计学意义（TLR4 mRNA：0h:P=0.4496；2h:P<0.0001, P2<0.01；6h:P<0.0001,12h:P<0.0001,24h:P24<0.005;TLR4蛋白：0h:P=0.0763,2h:P<0.01；6h:P<0.01；12h:P<0.01；24h:P<0.0.01；NF-?B mRNA：0h:P=0.9048；2h:P=0.0001；6h:P=0.001；12h:P=0.0001；24h:P=0.0001；NF-?B蛋白：0h：P=0.1277,2h：P<0.01；6h:P<0.05；12h:P<0.01；24h:P<0.001），且其表达量与诱导之间仍有时间依赖性；细胞中TLR4、NF-κB蛋白含量在检测时间段内随时间的延长逐渐升高，但与常温LPS组相同时间点比较其值明显降低的，有统计学意义（P<0.05）。
　　3．对照组：常温及亚低温对照组的炎症因子TNF-α、IL-10的含量在相同时间点没有统计学意义（P>0.05）；不同温度下的对照组细胞中Toll4、NF-κB基因转录水平和蛋白含量在相同时间点之间没有统计学意义（P>0.05）；正常对照组所检测的数值与LPS组在相同时间点比较明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。
　　结论：
　　在常温条件下，LPS刺激小胶质细胞触发氧化应激反应，使TLR4及其下游分子NF-κB的表达上调，促炎因子TNF-α在早期明显升高，抗炎因子IL-10的含量增加相对缓慢；在亚低温条件下，LPS诱导的小胶质细胞表达TLR4及其下游分子及释放炎症因子的含量在不同时间点表现为持续升高，但与常温LPS组相同时间点比较明显降低，具有统计学意义（P<0.05）。表明亚低温可以通过下调小胶质细胞TLR4/NF-KB信号分子的表达，减少促炎因子TNF-α的释放，对抗炎因子IL-10水平影响相对较小，使炎症反应趋于正向平衡，最终达到脑保护作用。

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1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1细胞

2.1.2 试剂

2.1.3 实验所需试剂配制方法

2.1.4 主要实验仪器设备及实验耗材

2.2 方法与步骤

2.2.1 小胶质细胞的分离和培养

2.2.2 LPS的配制及MTT法检测细胞活性（%）

2.2.3 实验分组与标本收集

2.2.4 TLR4、NF-KB的mRNA转录水平检测

2.2.5 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小胶质细胞培养上清液中TNF-a及IL-10含量

2.2.6 小胶质细胞中TLR4和NF-kB蛋白含量的测定

2.3 数据处理

3 结果

3.1 小胶质细胞形态学观察

3.2 各组的TNF-α、IL-10的检测结果

3.2.1 酶联免疫吸附法（ELISA）检测小胶质细胞培养上清中TNF-α含量

3.2.2 酶联免疫吸附法（ELISA）检测小胶质细胞培养上清液中IL-10水平

3.3 TLR4、NF-KB 在常温LPS感染组和亚低温LPS感染组mRNA转录水平变化

3.3.1 TLR4mRNA在各组不同时间点的表达

3.3.2 NF-κBmRNA在各组不同时间点的表达

3.5 LPS刺激小胶质细胞后各组TLR4和NF-KB 的Western Blot结果

3.4.1 TLR4在各组不同时间点的表达

3.4.2 NF-κB在各组不同时间点的表达

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述:亚低温的研究进展及医学应用前景