Tenascin基因与斑马鱼胚胎心脏发育的关系

摘要

先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是一类严重危害人类健康的先天畸形，其发生与心肌细胞和/或心脏特异传导细胞的异常分化、迁移等密切相关。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)及其受体在此过程中所起的重要的介导作用，已成为当前先天性心脏病病因研究领域的热点之一.Tenascin(TN)是一类存在于脊椎动物细胞外基质中的具高度保守性结构的寡聚体糖蛋白家族，通过调节基质黏附状态和基质间相互作用来促进细胞迁移、增殖和分化。目前已经发现四种TN的家族成员-C、-W、-x、-R。TNC是该家族中研究得最多的，不仅在胚胎发育时期有重要的作用，在成体病理状态下，如组织损伤、肿瘤等，也具有重要的功能。TNC与心脏病理状态也有密切联系，在人类动脉粥样硬化、心肌梗死、扩张性心肌病、心肌炎等疾病中均有作用，但TNC在心脏异常发育中的作用，国内外尚未有报导。 斑马鱼体外受精、胚胎透明、发育早期不依赖于有功能的血液循环，因此，有利于心脏观察和操作，本研究用斑马鱼为模型，通过原位杂交、RT-PCR技术检测tenascin-c(tnc).tenascin-w(tnw)和tenascin-r(tnr)在斑马鱼不同发育阶段的时空表达规律；予乙醇处理斑马鱼胚胎，观察处理后心脏形态的变化，并用原位杂交的方法检测tnc在心脏异常发育时表达的变化；予视黄酸、视黄醛脱氢酶抑制剂(DEAB)处理胚胎，并予显微注射的方法过表达tnc.hand2基因，结合原位杂交的方法以发现tnc与视黄酸信号及心脏发育的关系，从而为先天性心脏病的发病机制提供线索。 第一部分：tnc、tnw和tnr基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达规律目的观察tnc、tnw和tnr在斑马鱼发育过程中详细的时空表达规律。 方法：选择2hpf(hours post fertilization，受精后2小时)、4hpf,8hpf、10hpf,24hpf,48hpf,72hpf及7dpf(受精后7天)的斑马鱼，提取各个时期总RNA作RT-PCR，并固定各个时期胚胎作原位杂交，观察不同时期tnc、tnw和tnr在斑马鱼胚胎发育过程中的时空表达。 结果：tnc、tnw和tnp在斑马鱼2hpf-10hpf时无表达，在24hpf,48hpf、72hpf及7dpf有表达。tnc主要表达在斑马鱼咽弓、脊索、体节、听囊、胸鳍及后脑；tnw主要表达在咽弓、中脑、后脑、体节、脊索及听囊；tnr专一地表达在中枢神经系统的发育过程中。 结论：tnc和tnw在斑马鱼胚胎发育时期具有特异性时空表达规律，二者在斑马鱼胚胎发育过程中有密切联系；tnr在斑马鱼胚胎中特异地表达在发育的神经系统中，可以作为中枢神经系统发育的标志。三者在斑马鱼心脏正常发育过程中未检测到表达。 第二部分：乙醇诱导tnc基因在斑马鱼胚胎心脏中表达目的观察不同浓度乙醇对斑马鱼胚胎心脏发育的影响，探讨妊娠期乙醇暴露导致胎儿心血管畸形的相关机制，建立心脏异常发育模型，进而观察tnc基因在斑马鱼胚胎心脏异常发育过程中的表达变化。方法选择斑马鱼囊胚期(3hpf)、原肠期(5.7hpf)、体节期(18hpf)、咽囊期(24hpf)四个不同胚胎发育时间点，用不同浓度乙醇(100、200、300、400和500mM)持续处理斑马鱼胚胎，待胚胎发育至48hpf和72hpf时在解剖显微镜下实时观察斑马鱼心脏的发育；用200mM浓度乙醇短时处理5hpf胚胎至18hpf，待胚胎发育至48hpf和72hpf时观察心脏的发育；用RT-PCR及原位杂交的方法检测乙醇对nkx2.5基因表达的影响；用RT-PCR和原位杂交方法检测tnc在斑马鱼异常发育时表达的变化。 结果：300mM及以上浓度的乙醇持续处理导致斑马鱼胚胎出现包括心脏在内的多系统畸形；200mM乙醇持续暴露仅引起心脏环化异常，而200mM乙醇短时暴露并不引起心脏发育畸形；RT-PCR及原位杂交结果显示乙醇处理组nkx2.5基因的表达明显上调；100mM至400mM乙醇处理的胚胎，在48hpf观察时纫tnc在斑马鱼心脏部位均有表达。 结论：乙醇影响斑马鱼心脏发育有浓度依赖性和严格的时间窗，囊胚期和原肠胚期为乙醇干扰心脏环化的关键时期；200mM乙醇在此期间持续处理的斑马鱼胚胎可以作为研究心脏环化机制的模型；乙醇可能是通过诱导nkx2.5的表达而影响心脏环化；tnc在斑马鱼心脏异常发育中有表达，可能对心脏的正常发育起保护作用；tnc在病理状态下的表达模式不仅在脊椎动物中具有保守性，且在胚胎和成体时期均具有保守性。 第三部分：tenascin-c基因与视黄酸信号在斑马鱼胚胎心脏发育中的作用目的观察tnc基因在视黄酸信号变化时的表达变化，以及其与心脏发育相关基因hand2的相互关系，从而揭示tnc与视黄酸信号胚胎心脏发育中的作用，为先天性心脏病的发病机制提供线索。 方法：予视黄酸及视黄醛脱氢酶抑制剂(DEAB)分别处理斑马鱼胚胎，另予显微注射吗啡啉RNA(morphonino)的方法抑制视黄醛脱氢酶(raldh2)的表达，随后用原位杂交的方法观察经处理后的斑马鱼胚胎的形态变化以及tnc在心脏部位的表达变化；予显微注射在斑马鱼中过表达tnc基因，实时观察斑马鱼胚胎发育的过程，并予原位杂交检测gata5.hand2.gata4等基因的表达变化；用显微注射在斑马鱼胚胎过表达hand2基因，并予原位杂交检测tnc基因的表达变化。 结果：用视黄酸处理的斑马鱼胚胎，在72hpf并未观察到tnc在心脏部位表达，予视黄醛脱氢酶抑制剂处理的斑马鱼胚胎，在72hpf观察发现tnc在心脏部位表达明显上调；用显微注射抑制视黄醛脱氢酶Raldh2的表达，抑制视黄酸信号后，同样发现tnc在斑马鱼心脏部位表达上调；显微注射过表达tnc基因后，在显微镜下观察并未发现斑马鱼形态变化，原位杂交的方法也并未发现hand2.gata5.gata4基因的变化；显微注射过表达hand2基因后，斑马鱼心脏发育明显异常，同时观察到tnc在心脏部位的表达上调。 结论：抑制视黄酸信号后，tnc基因表达上调，说明视黄酸是tnc的上游调节信号，控制着tnc的表达；tnc过表达后，并未见心脏相关转录因子的变化；而hand2过表达后，可以见到tnc在心脏部位的表达上调，从而可以建立一条信号通路视黄酸信号-hand2-tnc。

目录

声明

摘要

第一部分tec、tnw、和tnr 基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达模式

1前言

2材料与方法

3 结果

4 讨论

第二部分乙醇诱导tnc基因在斑马鱼胚胎心脏的表达

1前言

2材料与方法

3结果

4 讨论

第三部分tenascin-c基因与视黄酸信号在斑马鱼胚胎心脏发育中的作用

1 前言

2 材料和方法

3结果

4 讨论

结论

参考文献

致谢

附1:综述

一 腱糖蛋白的研究进展

二视黄酸信号与胚胎心脏发育的关系

附2:在校期间发表论文及综述