细菌16S rRNA基因实时荧光定量PCR分型在外科感染性疾病中的应用

摘要

目的： 探索快速可靠检测外科感染性疾病病原菌的新方法。 方法： 分析细菌16S rRNA基因序列，在高度保守区自行设计通用引物和探针，以及革兰氏阳性和阴性分型探针，对12种标准菌株、23种临床培养分离株、乙型肝炎病毒、新型隐球菌及白色念珠菌、人基因组DNA等进行了荧光定量检测，分析三种探针检测结果的相关性。并用革兰氏阳性和阴性分型探针对外科急性阑尾炎、急性腹膜炎、急性肠套叠、肠梗阻以及皮肤软组织脓肿等疾病手术中所得的腹水或者脓液标本共102例行实时荧光定量PCR检测，结果与细菌培养做比较。 结果： 所有标本检测均在3小时以内完成；12种标准菌株、23种临床培养分离株均进行三种探针的荧光定量检测：通用探针均为阳性，18株革兰氏阳性菌株通过革兰氏阳性探针(G+Probe探针)检测为阳性，17株革兰氏阴性菌株通过革兰氏阴性探针(G-Probe探针)检测为阳性，反之均为阴性，吻合率100％；最低能检测到10个拷贝的16S rRNA基因，即相当于2个细菌，与病毒、真菌及人基因组DNA等无交叉阳性反应；感染性疾病腹水标本(包括急性阑尾炎和急性腹膜炎组病例标本)细菌16S rRNA基因实时荧光定量PCR检测阳性率为82.5％(66／80)，细菌培养阳性率为32.5％(26／80)，前者明显高于后者，差异有统计学意义(P<0.01)，且所有细菌培养G-阳性标本G-Probe探针检测结果均为阳性，所有细菌培养 G+阳性标本G+Probe探针检测结果均为阳性。36例G+Probe以及G-Probe探针检测结果均为阳性腹水标本中有22例标本细菌培养结果为G+或者G-单一细菌阳性。非感染性疾病组病例细菌16S rRNA基因实时荧光定量检测阳性率为6.25％(1／16)，细菌培养无阳性标本；脓液标本检测，细菌16S rRNA基因荧光定量PCR阳性率100％，高于细菌培养的50％。 结论： 细菌16S rRNA基因双探针实时荧光定量PCR法具备敏感性高、特异性好和方便快速等特点，可以在外科感染性疾病中给我们提供更全面的病原学资料，指导抗生素的合理应用。

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细菌16S rRNA及其基因检测的意义及应用

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