基于目标捕获和高通量测序检测耐药细菌的研究

摘要

目的:建立目标捕获和高通量测序相结合的方法，应用于临床耐药细菌的检测，达到同时获得菌株鉴定结果、耐药基因型及用于MLST分型的管家基因序列的目的，节约临床诊断的时间，综合分析本地区耐药基因的分布情况，为临床合理用药和进行流行病学监测提供科学依据。
　　方法:参考相关文献，选取大肠埃希菌常见的52种耐药基因，Genbank上下载耐药基因序列、大肠埃希菌16S rRNA基因序列及8个管家基因序列，序列交由美国 Agilent公司设计合成适配于高通量测序仪的Sureselect目标捕获试剂盒。对临床收集的4株产 ESBLs大肠埃希菌进行检测，建立目标捕获-高通量测序方法，并验证该方法的准确性和可重复性。应用目标捕获-高通量测序方法检测临床收集的22株产 ESBLs大肠埃希菌，检测结果经 BLAST比对，获得检测菌株的耐药基因型，结合药敏试验结果分析本地区大肠埃希菌的耐药特点；获得管家基因序列，使用 Pasture软件进行 MLST分型，分析菌株之间的流行病学关系。
　　结果:
　　（1）运用我们建立的目标捕获-高通量测序方法检测临床收集的4株产ESBLs大肠埃希菌，得到的16S rRNA基因序列经 BLAST比对后证实为大肠埃希菌，与 VITEK-2检测系统鉴定结果相一致。选取部分耐药基因采用 PCR-Sanger测序，两者测序结果完全一致。运用该方法重复检测这4株菌株，两次得到的结果一致。
　　（2）临床收集产 ESBLs大肠埃希菌22株，运用所建立的目标捕获-高通量测序方法进行检测，得到的16S rRNA基因序列经 BLAST比对后证实所有菌株为大肠埃希菌，与 VITEK-2检测系统鉴定结果相一致。
　　（3）得到的耐药基因序列经 BLAST比对，共得到24种耐药基因型。有20株检出8种 ESBLs基因，其中 CTX-M-14、CTX-M-55、CTX-M-15、CTX-M-27、CTX-M-65、SHV-12、OXA-1、OXA-10型的检出率分别为68.18％、45.45%、13.64%、4.55%、9.09%、18.18%、4.55%和4.55%。有3株检出 AmpC类耐药基因，均为 DHA-1型。有20株检出6种氨基糖苷类药物耐药基因，其中 aac(3)-II、aac(6’)-Ib、ant(3’’)-I、aph(3’)-I、aadA、rmtB型的检出率分别为63.63%、18.18%、13.64%、9.09%、31.82%和4.55%。有17株检出6种喹诺酮类药物耐药基因，其中 gyrA、gyrB、qnrB、qnrS、aac(6’)-Ib-cr、qepA型的检出率分别为45.45%、4.55%、4.55%、9.09%、36.36%和22.73%。有18株检出2种四环素类耐药基因，其中 tet(A)和tet(B)型的检出率分别为68.18%、45.45%。TEM-1型基因检出率为90.91%，其他耐药基因均未检出。所有菌株均检出三种及以上不同种类药物耐药基因。药敏结果显示所有菌株对第三代头孢菌素类药物耐药严重，多重耐药株在50%以上。
　　（4）得到的管家基因序列使用 Pasture软件进行 MLST分型，共得到16种不同的ST型，检出率最高的是 ST38型，共检出3株，其他还有 ST131型、ST405型等。
　　结论:
　　（1）成功构建了可同时完成菌株鉴定、耐药基因检测及流行病学分型的目标捕获-高通量测序方法，证明了该方法有很好的准确性和可重复性，初步证实该方法可应用于临床耐药菌的检测，给临床快速诊断和用药提供一定的科学依据。
　　（2）产 ESBLs大肠埃希菌耐药情况严峻，耐药基因检出率高。与β-内酰胺类相关的耐药基因主要为 TEM-1型和CTX-M-14型，与氨基糖苷类药物耐药相关的主要为 aac(3)-II型和aadA型，与喹诺酮类药物耐药相关的主要为 gyrA型与aac(6’)-Ib-cr型，与四环素类药物耐药相关的主要为 tet(A)型和tet(B)型。
　　（3）本研究中产 ESBLs大肠埃希菌遗传背景具有多样性，ST38型为主要流行ST型，ICU内有交叉感染的可能，需加强监测。

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引言

第一部分 临床分离产ESBLs大肠埃希菌耐药表现分析及常见耐药基因检测

1材料

2方法

3结果

4讨论

第二部分 目标捕获-高通量测序方法的建立

1材料

2方法

3结果

4讨论

第三部分 目标捕获-测序技术检测临床耐药细菌的应用

1材料

2方法

3结果

4讨论

结论

参考文献

附录A 细菌分型方案的发展及其比较

在 学 研 究 成 果

致谢