猪囊尾蚴SLC10未知功能分子在毕赤酵母中的表达与定位研究

摘要

SLC10是以绦虫保守的反式剪接引导序列为基础，通过RT-PCR从猪囊尾蚴中克隆出来的一个未知基因。其ORF为507bp，编码大小为18.2kD的蛋白，基因组全长1107bp，由两个外显子和一个内含子组成。本试验旨在选择巴斯德毕赤酵母表达系统 (Pichiapastoris Expression System) 在体外表达猪囊尾蚴SLC10蛋白，并进行组织定位，研究其在虫体中的功能，挖掘其应用潜力，为更进一步分析该蛋白的生物学特性奠定基础。从猪囊尾蚴中提取总RNA，用DANStar软件设计SLC10蛋白基因特异性引物，通过RT-PCR扩增出507bp的片段，扩增产物和真核表达载体pPIC9K分别用EcoR Ⅰ和NotⅠ酶切，将SLC10亚克隆至pPIC9K中，转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆。用Sac Ⅰ内切酶线性化重组质粒 pPIC9K-SLC10，然后电转化毕赤酵母SMD1168。将所有在营养缺陷型选择培养基MD上生长出的转化子，采用G418浓度梯度进行筛选，获得的高拷贝重组菌株，用PCR检测表明有目的基因整合。用1﹪甲醇诱导表达重组菌株，通过SDS-PAGE、ELISA对表达产物进行分析。结果表明，SLC10蛋白基因在毕赤酵母中成功表达，表达产物的分子量为18ku左右，用亲和层析纯化的重组蛋白作为包被抗原进行ELISA检测，发现70份囊尾蚴阴性血清和75份囊尾蚴阳性血清都不与其发生反应，说明SLC10重组蛋白不能被人囊虫阳性血清所识别，不具有免疫反应性。将纯化的SLC10重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，进行免疫组织化学研究。试验证明，SLC10天然蛋白主要分布在除猪囊尾蚴头节以外的囊壁内部。因此预言，SLC10蛋白为非分泌型结构蛋白，与诱导宿主产生抵抗囊尾蚴感染的免疫应答无关。

目录

文摘

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第一章引言

第二章猪囊尾蚴SLC10基因的克隆、表达及组织定位

2.1材料和方法

2.2结 果

2.3讨 论

2.4结 论

第三章文献综述

3.1利用嗜甲醇酵母表达外源基因的研究进展

3.2 SL反式剪接简介

参考文献

附录

致谢

作者简介