白蛋白治疗对脑缺血海马和皮层VEGF、flt-1的影响

摘要

目的：缺血性脑血管病(ischemic cerebral vascular disease，ICVD)是导致病人死亡和致残的首要原因，是目前重点防治的一种疾病，由于脑缺血再灌注后有害的生化级联反应，使得临床对卒中尚无有效的疗法。白蛋白治疗是近年发现的能对抗多种脑缺血再灌注(cerebral ischemic reperfusion，CIR)损伤机制的神经保护剂，本课题旨在建立更接近临床卒中的系统的成年鼠局灶性脑缺血再灌注实验动物模型与疗效判定方法，利用核磁共振技术、神经功能评价、病理学染色、全定量Real-time QRT-PCR技术，深入、全面地探索脑缺血再灌注后海马、皮层的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体fam样酪氨酸激酶-1(fms-like tyrosine kinase-1，flt-1)mRNA表达的时间．空间分布特征；以及白蛋白治疗的保护作用在缺血再灌注后梗死半球海马、皮层的血管再生方面的分子机制，将白蛋白治疗更好地应用于临床卒中的脑保护。 方法：本课题以雄性Sprague-Dawley(S-D)大鼠作为实验对象，体重260g-280g。将所有大鼠随机分为正常对照组、假手术组、脑缺血2h再灌注后不同时程生理盐水对照(Saline)组、脑缺血2h再灌注后对应时程白蛋白(Albumin)治疗组。使用线栓法行大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAo)，造成局灶性脑缺血2h再灌注6h，1d，2d，3d，5d模型。以上每组不同时程、不同治疗和不同对照组的每一亚组检测例数均在5只以上。脑缺血再灌注模型制备与疗效判定采用国际认同的Zea longa提出的可逆性大脑中动脉闭塞线栓法并加以改进制作局灶性脑缺血再灌注模型。对MCAo 2h再灌注后及治疗后不同时间点的活体模型的判定采用症状、体征、病理学和影像学表现相结合的严格判定模型可靠性的方法，舍弃脑缺血再灌注后核磁共振无改变的模型，仅对成功模型进行治疗前后改变的活体动态观察，并对进行影像学检查后的动物模型在规定时间点处死，进行病理学HE和TTC染色。采用溴甲酚氯法(BCG)测定不同时间点的血清白蛋白水平，采用LightCycler Real-Time RT-PCR法全定量测定VEGF/flt-1mRNA水平表达的时间和空间分布特征。评价脑缺血再灌注后生理盐水及白蛋白治疗后，在脑缺血海马、皮层特定区域，VEGF表达与血管再生和预后的关系。 结果： (1)神经功能评分：所有局灶性脑缺血再灌注模型在麻醉苏醒后均表现为局灶性神经功能缺陷，表现为右下肢无力、伸直，行走时向右侧转圈，提尾反射，部分表现Homer's征。 (2)TTC染色及MRI：可见梗死侧大脑中动脉分布区出现梗死灶。 (3)HE染色：海马区锥体细胞出现异常变化，排列散乱，大量变性，变性的锥体细胞核固缩深染，胞浆嗜伊红，胞膜破裂，胞内容物释放。皮层和海马的神经元呈缺血性改变，可见胶质水肿，胶质细胞稀疏变性，随时间延长，缺血性改变加重。 (4)Alb治疗明显改善神经功能评分，在脑缺血再灌注后1 d，2 d,3 d神经功能评分与SMme对照组相比分别下降25％(p<0.05)，37％(p<0.05)和40％(p<0.01)。 (5)血清白蛋白水平的变化：SMine对照组，脑缺血再灌注2 h到72 h血清白蛋白水平明显低于术前水平(p<0.05)，第5天恢复正常。Alb治疗组，CIR6 h到5 d血清白蛋白水平与正常水平相比无明显变化(p>0.05)。Alb治疗后，CIR6h(p<0.01)，1d(p<0.01)，2 d(p<0.01)，3 d(p<0.05)血清白蛋白水平明显高于SMine对照组。 (6)VEGF mRNA表达水平：海马，Saline对照组，VEGF mRNA在6 h表达增强并达峰值，1 d开始下降，2 d恢复基线水平。Alb治疗组，VEGF mRNA的表达趋势与Saline对照组相似，但6 h的峰值水平明显降低(p<0.05)，3 d又高于Saline对照组。皮层，Saline对照组，VEGF mRNA在6 h表达增强，1 d达到高峰，峰值持续到3 d，之后开始下降，第5 d仍高于基线水平。Alb治疗组，6 h，1 d均显著低于Saline对照组(p<0.05)。 (7)flt-1 mRNA表达水平：海马，Saline对照组，CIR6h即有微量表达，1d达高峰，2d恢复正常水平。A1b治疗组，CIR各个时间点均有表达，3d达峰值，5d仍有少量表达；6h，1d，2d显著低于Saline对照组(p<0.05)。皮层，Saline对照组，6h，1d，2 d与正常对照组相比无明显差异，3 d达峰值(p<0.01)，5 d恢复基线水平。Alb治疗后，flt-1的表达趋势与Saline对照组相似，6h和1d显著低于Saline对照组(p<0.01)。 (8)VEGF mRNA水平与神经功能评分呈指数相关，r=0.865，p=0.029。脑缺血再灌注6h-2d VEGF水平越高，神经功能评分也越高，说明神经功能缺损也越严重；脑缺血再灌注3d-5d VEGF水平趋于缓和，神经功能评分变化不大，说明神经功能缺损减轻。 结论： (1)综合运用MRI、神经功能评价、病理学染色等技术建立了更接近临床卒中的MCAo模型，更好的模拟了人类局灶性脑缺血再灌注的不同状态。 (2)脑缺血再灌注引起血清白蛋白水平明显下降，Alb治疗能维持血清白蛋白的正常水平，并显著改善神经功能评分。 (3)脑缺血诱导VEGF/flt-1表达，VEGF高表达促进其受体flt-1的表达。 (4)脑缺血再灌注损伤后VEGF及其受体flt-1 mRNA的表达在梗死半球海马和皮层的修复过程中起重要作用。 (5)VEGF的表达有区域性，海马的峰值出现时间(6h)比皮层(1d)早，皮层的峰值持续时间(1d-3d)比海马(6h-1d)长。 (6)脑缺血再灌注急性期(6h-1d)，白蛋白治疗能下调升高的VEGF mRNA水平，减轻VEGF引起的血管渗漏和脑水肿；CIR晚期(3d-5d)，白蛋白能上调VEGF mRNA表达水平，促进VEGF的血管再生和神经再生作用。 (7)VEGF mRNA水平与神经功能评分呈指数相关，可作为急性卒中的预后指标之一。

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