补体C5b-9复合物对人RPE细胞膜通透性及VEGF、TGF-β2表达的影响

摘要

目的：补体系统激活，发生级联反应，是人体抵御外来侵害的第一线，但如果反应过度，则损伤正常组织而致病，其在老年性黄斑变性(AMD)的脉络膜新生血管(CNV)发病中的作用越来越受关注。补体C5b-9复合物，是补体级联反应的终末产物，在AMD患者CNV区域的视网膜色素上皮(RPE)细胞表面可检测到其存在。本研究通过观察补体C5b-9复合物与人RPE细胞膜结合后细胞的形态学改变、胞浆内钙离子浓度变化及血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)-β2mRNA水平变化，探讨补体C5b-9复合物对人RPE细胞膜通透性及细胞分子生物学行为的影响，探讨补体C5b-9复合物在CNV发病中的作用。 方法：1.采用胰蛋白酶消化法培养人原代RPE细胞，并使用细胞角蛋白抗体免疫组织化学染色鉴定。细胞传代至第2代一第3代用于后继实验。2.采用大鼠血清接触兔红细胞提取补体C5b-9复合物，蔗糖密度梯度超速离心法收集，并提纯、鉴定。3.取培养的人RPE细胞，加入不同浓度补体C5b-9复合物，分别为0、1、10、20、40、80μg/ml，处理24h，光学显微镜观察细胞形态学改变。并根据细胞膜有无溶破确定本研究后继实验采用的补体C5b-9复合物剂量。4.取正常RPE细胞和经补体C5b-9复合物作用后1h的RPE细胞，制作透射电子显微镜标本，观察细胞超微结构的改变。5.将正常培养的人RPE细胞按1×104/ml接种于特制的激光共聚焦显微镜专用培养皿。以钙荧光指示剂Fluo-3/AM负载。于激光共聚焦显微镜下，选定负载良好的RPE细胞视野，加入补体C5b-9复合物，观察细胞内钙荧光强度的变化。总的观察时间15min，间隔时间15s。随机选取视野内20个不同细胞，对所选区域进行荧光强度的定量分析，并记录该区域荧光强度的全程变化情况。6.取培养的人RPE细胞在补体C5b-9复合物作用4h、24h后，分别提取各时间组及正常培养的细胞总RNA，逆转录后行PCR检测VEGF、TGF-β2mRNA的相对表达量。结果采用SPSS13.0统计软件，方差分析法进行统计学分析，对各组均数之间比较。 结果：1.体外培养的人原代RPE细胞，48h细胞贴壁，5-10d融合，传代稳定。细胞角蛋白抗体免疫组织化学染色阳性，符合上皮细胞特征。2.提取的补体C5b-9复合物经SDS-PAGE法鉴定，电泳呈现7条带，从上至下依次为C5b、C5c、C6、C7、C8αγ、C9和C8β，与文献相符。3.1、10、20μg/ml补体C5b-9复合物作用24h，细胞形态无明显改变。40μg/ml补体C5b-9复合物作用24h，细胞边界模糊，部分结构消失，培养液内可见大量黑色素颗粒。80μg/ml补体C5b-9复合物作用24h，仅见极少量完整RPE细胞，培养液充满黑色素颗粒。20μg/ml作为进一步实验选用剂量。4.透射电子显微镜下，正常培养的人RPE细胞胞膜完整，在细胞的一面可见到大量的绒毛组织，胞浆内存在大量的圆形或椭圆形色素颗粒，胞浆外未见杂质结构。20μg/ml补体C5b-9复合物作用RPE细胞后，透射电子显微镜显示色素颗粒从细胞内释出，细胞膜未见明显缺损，细胞周围可见色素颗粒团。5.培养的人RPE细胞以10μmol/l的钙荧光探针Fluo-3/AM，37℃孵育30min，可获得最佳负载效果。在激光共聚焦显微镜下，20μg/ml补体C5b-9复合物作用人RPE细胞后，多数细胞内的Ca2+荧光迅速增强，4min达到最大值，持续约6min后大部分细胞内升高的Ca2+荧光开始下降，随时间推移逐渐恢复至静息水平。6.20μg/ml补体C5b-9复合物作用人RPE细胞4、24h及正常对照组，VEGFmRNA的相对表达量分别为：1.53±0.49，1.32±0.39，1.00±0.15。与对照组比较，补体C5b-9复合物作用后4h，VEGF表达明显升高(p<0.01)；之后有下调趋势，但24h与4h统计学无明显差异(p>0.01)。TGF-β2mRNA的相对表达量分别为：0.72±0.13，0.46±0.22，0.24±0.076。与对照组比较，补体C5b-9复合物作用后4hTGF-β2表达升高(p<0.01)；24h下降(p<0.01)，但仍高于对照组(p<0.01)。 结论：1.本研究采用胰蛋白酶消化法成功培养了人原代RPE细胞，细胞传代稳定，可满足实验研究需求。2.本研究通过实验室提取补体C5b-9复合物作用人RPE细胞，首次证实补体C5b-9复合物可改变RPE细胞膜的通透性，效果与补体C5b-9复合物的作用剂量相关。大剂量补体C5b-9复合物直接导致RPE细胞膜破碎，细胞坏死，降低作用剂量，则仅有色素颗粒通过RPE细胞膜释出。3.本研究首次证实补体C5b-9复合物可导致RPE细胞胞浆内Ca2+升高和VEGF、TGF-β2mRNA上调，认为此分子生物学行为的改变是补体C5b-9复合物参与CNV形成的机制之一。4.本研究发现补体C5b-9复合物作用RPE细胞后，VEGF、TGF-β2mRNA水平的变化与胞浆内钙离子变化趋势一致，认为VEGF、TGF-β2mRNA上调与胞浆内Ca2+增高有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明

声明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、人RPE细胞的培养

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、补体C5b-9复合物对人RPE细胞的膜结合作用

2.1对象与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、补体C5b-9复合物对人RPE细胞内钙离子及VEGF、TGF-β2mHNA表达的影响

3.1对象与方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 老年性黄斑变性发病机制研究进展

致谢