慢病毒介导的转化生长因子β不敏感肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的构建及鉴定

摘要

目的:肿瘤细胞分泌大量的转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)，具有潜在的免疫抑制功能。因此，肿瘤细胞能够逃避宿主细胞的免疫监视而进展和转移。肿瘤分泌的TGF-β抑制宿主的免疫系统，特别是细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)对其的识别杀伤。鉴于TGFβ在肿瘤发展过程中的负性免疫调节作用，使CTL对TGFβ失去敏感性可以恢复其对肿瘤的杀伤活性。因此，TGF-β是抗肿瘤治疗的重要靶点之一。肿瘤免疫治疗大多着眼于增强机体免疫系统的抗肿瘤活性，所以针对肿瘤免疫抑制的免疫疗法是很有前景的。肿瘤特异性CTL是体内抗肿瘤免疫最为有效的效应细胞，但其激活需要抗原呈递细胞(antigen-presentingcells，APC)处理并呈递相应的抗原。树突状细胞(Dendriticcells，DC)是目前已知功能最强的APC，可以激活初始T细胞(naiveTcell)和记忆性T细胞。DC可提供T细胞活化所需的共刺激信号，在体内外诱导CTL的生成。肿瘤组织匀浆、细胞裂解物包含全部抗原信息，用其致敏DC细胞，体外可以激发T细胞大量增殖，产生肿瘤特异性CTL。鉴于TGFβ在肿瘤发展过程中的负性免疫调节作用，使CTL对TGFβ失去敏感性可以恢复其对肿瘤的杀伤活性，用含有TβRIIDNglytk质粒的慢病毒来感染肿瘤特异性CTL使其对TGFβ失去敏感性后发挥抗肿瘤效应。本实验中将HSV-tk引入，当肿瘤细胞被消除或CTL量过大时，给予适量GCV能够使这些CTL自杀，避免其产生毒副作用。 方法:我们用TOPO技术将显性负相TGF-βII型受体(dominantnegativeTGFβtypeIIreceptor，TβRIIDN)与单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirusthymidinekinase，HSV-tk)连接起来后转入慢病毒载体，构建表达TβRIIDNglytk的慢病毒，并构建TRANSglytk为对照；用DC、肿瘤组织匀浆、T淋巴细胞培养出肿瘤特异性CTL；然后以慢病毒为载体将TβRIIDNglytk基因转染到肿瘤特异性CTL，从而去除了TGF-β对肿瘤特异性CTL的抑制作用，恢复CTL对肿瘤的识别杀伤；最后通过荧光抗体染色，Western-blot，MTT，流式细胞术等方法对其进行了分析、鉴定。Smad2/3磷酸化是TGFβ活化的直接结果，是TGFβ信号传导通路的关键点所在，TGFβ处理过的CTL若P-Smad2/3表达缺失则认为是TGFβ信号传导通路被阻断，细胞对TGFβ不敏感。Westernblot分析不同类型CTL磷酸化的Smad2/3(P-Smad2/3)量可以鉴别其对TGFβ的敏感性。表达TRANSglytk的CTL为对照。 结果:1.利用重组PCR技术连接TβRIIDN(TRANS)与HSV-tk连接起来转入慢病毒载体，测序验证正确，成功构建了表达TβRIIDNglytk及对照TRANSglytk的慢病毒。 2.外周血来源PBMC，在IL-4、GM-CSF诱导下，可得到DC。负载肿瘤抗原DC，激活T细胞，可使其大量扩增，得到肿瘤特异性CTL。 3.以慢病毒为载体可将TβRIIDN-tk基因转染到肿瘤特异性CTL，Anti-v5-TIFC荧光抗体染色证实了转染成功，Western-blot检测P-Smad2/3蛋白表达明显减少，证明转染TβRIIDNglytk基因后TGF-β信号传导通路阻断，对正常表达的TGF-βII型受体产生了竞争性抑制作用。 4.转染TβRIIDN-tk，TRANS基因对淋巴细胞表型，凋亡，周期无明显影响。GCV对携带HSV-tk自杀基因的TGF-β不敏感CTL杀伤活性结果表明GCV能够杀死经慢病毒转染后表达HSV-tk的细胞，而未转染组细胞几乎无死亡。 结论:对TGF-β不敏感肿瘤特异性CTL培养成功及鉴定表明：这一方法在肿瘤免疫治疗中具有潜在的应用前景，为肿瘤的过继免疫治疗提供了又一新的思路。

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1主要试剂

2主要仪器

3实验步骤

结果

讨论

结论

参考文献

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综述 削弱TGF-β负性免疫调节作用在进展期肿瘤治疗中的应用

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