利用农杆菌介导法将TT1基因导入水稻的研究

摘要

水稻是一种世界性的重要粮食作物，我国一半以上的人口以稻米为主食。随着工业化的加快和温室效应的加剧，全球气温变暖使水稻的正常生长和发育受到严重影响。水稻在高温条件下不能正常生长，造成花粉发育不良，活力下降，导致严重的产量损失和品质下降。提高水稻的耐热性已成为一个迫切需要解决的问题。自然界中具有耐热抗性的水稻品种极少且农艺性状不佳，因此通过基因工程技术将已有的耐热基因导入水稻中，选育耐热水稻品种，对适应耕地减少，人口增加等局势具有重要意义。 TT1基因是从甘蓝型油菜中克隆出的一个可提高植物热胁迫抗性的耐热基因，是目前少有的能提高植物耐热性的基因。该基因已经被成功的转入油菜中，结果显示TT1基因的表达能够增加油菜的耐热受性。因此，若能利用基因工程技术使TT1基因在水稻中高效表达，必将为水稻耐热性研究提供一个新的优良品种资源。本研究通过农杆菌介导法将构建在载体T-DNA上的耐热基因TT1导入水稻品种日本晴中，以验证其在水稻中的表达情况，实验取得了以下结果： 1.对不同成熟度的日本晴种子进行愈伤诱导，诱导率为：幼嫩种子>饱绿种子>饱黄种子。而污染率为：饱黄种子<饱绿种子<幼嫩种子。 2.在共培养过程中，日本晴幼胚愈伤组织最适共培养时间为2.5天，成熟胚愈伤组织最适共培养时间为3天。二者的最适共培养温度都为22℃。经过浸染和筛选后转入分化培养基中二者都得到了再生苗，幼胚的分化率高于成熟胚。 3.以潮霉素为筛选剂分别对日本晴幼胚和成熟胚愈伤组织进行筛选压的确定，结果发现：两者的最佳筛选浓度都为50mg/L。 4.对日本晴成熟胚和幼胚愈伤组织再生苗进行PCR验证，证明外源TT1基因已整合到受体植株的DNA中。通过RT-PCR进一步验证，证明TT1基因在植株的RNA水平上进行了表达。 5.通过对非转化植株和转化植株进行耐热性鉴定，发现非转化植株在50℃的条件下处理2h后干枯死亡，而转基因植株在同样条件下表现正常。转基因植株在57℃的条件下处理2h后干枯死亡。

目录

文摘

英文文摘

声明

Ⅰ文献综述

1 水稻耐热性研究进展

1.1 高温对水稻的影响

1.2 水稻耐热性的鉴定和评价

1.3 水稻耐热性及育种研究

2 水稻转化受体系统

2.1 原生质体再生系统

2.2 愈伤组织再生系统

2.3 幼嫩子房、花粉、卵细胞、幼胚

3 转基因方法

3.1 基因枪法

3.2 农杆菌介导法

3.3 PEG转化法

3.4 电激法

3.5 花粉管通道法

3.6 脂质体转化法

3.7 激光微束介导转化法

3.8 低能离子束介导法

4 水稻转基因研究存在的问题

4.1 可利用的基因较少，大部分研究处于研究探索阶段

4.2 转基因沉默

4.3 转基因植物的环境安全性问题

5 本研究的目的和意义

Ⅱ材料和方法

1 实验材料

1.1 供试品种

1.2 质粒及菌种

1.3 试剂的配制

1.4 重要试剂及溶液

1.5 重要仪器设备

2 水稻转基因系统的建立

2.1 外植体培养方法

2.2 农杆菌介导的遗传转化

2.3 水稻基因转化实验方法

3 转基因水稻苗的分子生物学检测

3.1 再生植株DNA微量提取

3.2 转基因水稻植株中hpt基因的PCR检测

3.3 转基因水稻植株中TT1 基因的PCR检测

3.4 RNA的提取

3.5 One Step RT-PCR的方法

Ⅲ结果与分析

1 日本晴种子不同成熟度对愈伤诱导的影响

2 日本晴不同外植体诱导的愈伤组织共培养时间及生长状况比较

3 共培养温度对抗性愈伤率的影响

4 潮霉素(Hyg)筛选压的确定

5 日本晴不同外植体愈伤组织经农杆菌介导转化后的稳定转化表现

6 转化植株的分子生物学检测结果

6.1 对转化植株hpt基因和TT1 基因的PCR分析

6.2 对转化植株所含TT1 基因进行RT-PCR分析

7 转化植株耐热性测试

Ⅳ讨论

1 水稻转基因体系的完善

1.1 转化受体的选择

1.2 共培养过程的优化

2 日本晴成熟胚和幼胚作为外植体的遗传转化比较

3 水稻植株耐热性评价

Ⅴ附图

参考文献

致谢