重组腺病毒介导的反义MMP-2cDNA基因治疗人表皮癌的实验研究

摘要

肿瘤是危害人类健康最严重的疾病之一，在癌细胞生物学特性中，以侵袭性和转移性最为关键，也是恶性肿瘤的重要标志。抑制肿瘤的侵袭和转移是治疗肿瘤的重要靶点。大量实验证明瘤细胞侵袭转移能力与其诱导产生蛋白酶降解细胞外基质(extraeelluar matrix，ECM)、基底膜的能力密切相关。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是其中最重要的一组蛋白酶，几乎能降解所有的细胞外基质和基底膜成分,MMPs可以通过分解ECM成分来调节和重组它们之间的动态平衡，以达到消除某些特殊信号、显现某些隐含信号、甚至使基质已存在的生物活性物质释放或激活的目的，进而参与细胞和组织器官的各种形态和功能变化。MMPs在肿瘤侵袭转移中的作用可概括如下：(1)破坏局部组织结构，促进肿瘤生长。(2)破坏基底膜屏障，有利于肿瘤侵袭转移。(3)通过对细胞外基质的改变，促进肿瘤新生血管的形成。因此，通过转染反义MMP2基因作基因治疗，抑制恶性肿瘤细胞中MMP2的分泌，将成为恶性肿瘤治疗的重要手段。 本研究采用反义MMP2-cDNA基因在mRNA水平抑制靶基因表达的策略，以重组腺病毒介导的反义MMP2-cDNA基因转染的方法，感染人表皮癌(Human epidermal carcinoma,HEC)细胞和人表皮癌(Humanepidermal carcinoma,HEC)裸鼠移植瘤，分别从体内和体外实验两方面研究反义MMP2-cDNA基因感染对靶细胞或／和组织的生物学特性和血管新生的影响，探讨反义MMP2-cDNA基因在治疗表皮癌中的意义，为进一步开展临床应用研究奠定基础。 第一部分 重组腺病毒介导的反义基质金属蛋白酶-2cDNA(Ad-aMMP-2cDNA)的扩增、纯化和滴度测定 目的：扩增、纯化Ad-GFP和Ad-aMMP2cDNA，并测定滴度。方法：在293腺病毒包装细胞中复制和扩增Ad-GFP和Ad-aMMP2cDNA。反复冻融293细胞，提取腺病毒悬液，用氯化铯(CsCl<,2>)梯度离心法纯化腺病毒，在荧光显微镜下测定Ad-GFP的滴度，用空斑法测定Ad-aMMP2cDNA的滴度。结果：获取了实验所需的第四代腺病毒液(Ad-GFP和Ad-aMMP2cDNA)，Ad-GFP的滴度为8.5×10<'9>efu／ml，Ad-aMMP-2cDNA的滴度为1.8 X 10<'9>pfu／ml。结论：该实验制备了本研究所需的高滴度的Ad-GFP和Ad-aMMP2cDNA腺病毒。 第二部分 反义MMP2基因对表皮癌作用的体外实验研究 目的：用Ad-aMMP2cDNA转染人表皮癌细胞A431后，观察其对体外培养A431生物学特性的影响，为以后的体内实验奠定基础。方法：选用不同感染复数(multiplicity of infection，MOI)的Ad-GFP转染A431，测定转染效率；用Ad-GFP和Ad-aMMP2cDNA腺病毒液感染A431，测定其生长曲线(MTT)，并通过侵袭实验、明胶酶实验和Western Blotting在分子水平和蛋白水平检测MMP2的表达。结果：当MOI=100时A431的感染效率为84.3％，对细胞的毒性较小，是理想的感染效率，增殖实验和侵袭实验表明，Ad-aMMP2cDNA对A431的生长和侵袭能力没有明显影响，明胶酶实验和Western Blotting表明，Ad-aMMP2cDNA能抑制A431分泌MMP2，能明显下调肿瘤细胞内源性MMP2的表达。结论：1．腺病毒介导的报告基因GFP在A431中能够有效感染并表达。 目的：研究Ad-aMMP2cDNA基因转染对裸鼠体内表皮癌种植瘤生长和生物学特性的影响。方法：裸鼠右腋下接种A431细胞，一周后瘤块形成并进行转种和分组治疗，共分为三组：PBS组、Ad-GFP组和Ad-aMMP2组，每周瘤内注射两次，共四次。进行大体和组织形态学观察，并用免疫组化检测瘤体MMP2和MVD的变化。结果：成功地建立了荷瘤裸鼠模型，Ad-aMMP2能抑制体内肿瘤的生长，无明显的毒副作用；组织学切片观察到Ad-aMMP2组有较多的组织坏死，免疫组化观察到Ad．aMMP2cDNA能抑制A431细胞MMP2的表达，降低瘤体内的血管密度。结论：反义MMP2基因可以抑制人表皮癌(Human epidermalcarcinoma,HEC)的生长和转移，其机理是通过抑制肿瘤分泌MMP2和减少血管生成。

目录

论文说明：英文缩写

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摘要

研究背景

第一部分重组反义MMP2腺病毒的扩增、纯化和滴度测定

第二部分反义MMP2基因对表皮癌作用的体外实验研究

第三部分反义MMP2基因对表皮癌作用的体内研究

全文总结

实验彩色图片

实验参考文献

综述 基质金属蛋白酶及其抑制剂在肿瘤侵袭转移和生物治疗中的作用

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