HSP70/HSP70-PC在舌癌热疗联合CTL免疫疗法中作用机制的研究

摘要

目的： 舌癌及颊黏膜癌是常见的口腔鳞癌，目前口腔鳞癌的治疗一般以手术切除为主，加以化疗及放疗方案，平均5年生存率在50-60％左右，其晚期5年生存率尚不到30％。因此，寻找既能提高疗效，又能避免毁容和破坏口颌系统功能的新治疗方法，成为口腔鳞癌治疗的一个方向；研究证实热疗过程中加热诱发热休克蛋白(HSPs)表达与热耐受密切相关，因此，一次加热后只能待HSPs表达减退热耐受消失后才能行第二次加热，这样在肿瘤的热疗中就形成了治疗盲区，如何克服与HSPs高表达密切相关的热耐受成为提高热疗疗效的关键。 肿瘤免疫以细胞免疫为主，细胞免疫学研究主要目的之一是寻求肿瘤特异性抗原，活化杀伤肿瘤细胞的特异性T淋巴细胞(CTL)，增加机体对肿瘤排斥反应；HSP70可以通过MHC-I类APC途径递呈抗原，刺激抗原特异性CD8<'+>T细胞免疫反应。肿瘤细胞死亡过程中诱导HSP70高表达或从肿瘤细胞分离的HSP70能够活化CTL引发机体抗瘤免疫反应，HSP70在细胞膜表达参与了内源性肿瘤抗原肽与HSP70结合形成“分子伴侣”，通过APC表面的HSP70受体介导，在抗原呈递过程中发挥了重要作用。 基于以上认识，从过去为降低热耐受而想方设法降低HSP70表达，转变为利用热疗后IISP70表达的高峰期施以I-ISP70-PC为结构基础的免疫疗法，把肿瘤热疗和免疫疗法有机结合起来，扬长避短，既避免了热疗中形成的热疗耐受所导致的治疗“盲区”，又克服了免疫治疗中HSP70表达率低的缺点。本课题以此思路为立题依据，探索一条口腔癌治疗的新策略，即热疗联合HSP70／HSP70-PC诱导的CTL免疫疗法治疗口腔癌。 方法： 本研究采用流式细胞技术和免疫组化方法研究舌癌Tea8113细胞热休克后HSP70的表达，选取43℃加热30min条件，通过检测人舌癌Tca8113细胞内和细胞膜HSP70的动态表达，确定HSP70表达的峰值时间：然后在热休克诱导HSP70高表达峰值时段，用亲和层析方法提纯HSP70多肽并用Western blot鉴定；将提纯的HSP70多肽体外刺激人脾淋巴细胞扩增、活化，然后用MTT法测定其对舌癌Tea8113细胞的杀伤作用，并用电镜观察其培养上清诱导舌癌Tea8113细胞的形态学变化；进而在舌癌裸鼠移植瘤模型上，采用热疗联合致敏CTL瘤周注射，观察对裸鼠Tca8 113移植瘤的抑瘤效果。 结果： 1、43℃加热30min后恢复12h组Tea8113细胞内和细胞膜表达均较强，细胞膜上有较高的HSP70表达且具有可诱导性，再次加热后12h组细胞活性最高； 2、1g湿重的肿瘤细胞可提取纯化HSP70蛋白85μg，通过SDS-PAGE和Western blot证实为HSP抗原肽复合物； 3、人舌鳞癌Tea8113细胞HSP70-PC与体外免疫扩增的人脾淋巴细胞与Tca8113细胞当效靶比为100：1和50：1时，致敏CTL的杀伤率分别为(77.4±2.9)％和(78.9±1.9)％，两组间没有显著差异(P>0.05)。HSP70诱导的CTL对Tca8113的杀伤率与非抗原刺激的淋巴细胞比较，有统计学显著性差异(P<0.01)，其培养上清能诱导舌癌Tca8113细胞出现凋亡的形态学变化； 4、热疗HT+CTL+IL-2组和CTL+IL-2+HT组抑瘤率分别为68.85％，61.8％，两组HsP70表达OD值和肿瘤细胞凋亡率与对照组比较均有显著性差异(P<0.01)。 结论： 1、HSP70的迅速表达与缓慢降解对维持Tea8113细胞的生理功能有重要作用，肿瘤细胞HSP70的高表达与其生物学行为相关： 2、Tca8113细胞来源的HSP70多肽能刺激脾淋巴细胞产生特异性杀伤肿瘤细胞的效应，并能介导肿瘤细胞凋亡： 3、肿瘤来源的热休克蛋白HSP70具有较强的刺激T淋巴细胞增殖的能力，所致敏的CTL对靶肿瘤细胞有明显的特异性杀伤作用； 4、热疗联合致敏CTL的免疫治疗有显著的抑瘤效应，HSP70-PC起到了抗原提呈和肿瘤抗原疫苗作用。

目录

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缩略词表

前 言

第一部分热休克诱导舌鳞癌Tca8113细胞HSP70表达的研究

第二部分人舌癌Tca8113细胞热休克蛋白多肽复合物(HSP70-PC)的提取和鉴定

第三部分HSP70多肽复合物介导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对Tca8113细胞的免疫杀伤作用

第四部分热疗联合致敏的CTL对裸鼠移植瘤的抑瘤效应研究

全文总结

附图

参考文献

文献综述HSP70与肿瘤免疫

研究生简介

致谢