Notch信号传导途径与肿瘤基因治疗相关性的研究

摘要

恶性肿瘤是人类死亡的主要原因之一，手术、放疗和化疗等传统的治疗方法对肿瘤治疗的效果不甚理想。从根本上来说，恶性肿瘤的发生和发展仍然源于体内基因表达的异常，因此，基因治疗才是人类彻底征服肿瘤的希望。关于肿瘤的基因治疗研究包括许多方面，其中从分子水平上彻底了解各种肿瘤的发生发展机制仍然是不可逃避的问题。由于生物系统的高度复杂性，目前发现肿瘤的相关基因众多，Notch信号传导途径也被越来越多的实验室证明其与各种肿瘤的发生和发展关系密切，尽管目前对其本身的生物学作用尚未有个明确的定义。Notch基因编码一个跨膜的异二聚体受体，受体激活后引起的一系列细胞内的分子信号的改变称为Notch途径，正常情况下Notch途径的功能和参与调节细胞生长、稳定分化和凋亡有关。近来在许多肿瘤细胞系中发现Notch基因表达的失常，且失控的Notch途径在维持肿瘤表型方面起着重要作用。本研究通过RNA干扰Notch1的方法和重组逆转录病毒过表达Notch1活性部分的方法对。Notch途径与不同肿瘤细胞相关性作了初步探讨，并利用RNA干扰的方法进行了针对Notch1的基因治疗的尝试。 一、RNA干扰阻断Notch途径对肿瘤生长的影响。 本部分实验通过RNA干扰(RNAi)的方法对一系列现有的肿瘤细胞进行相关性研究，实验设计了两种siRNA分别针对PSl和Notchl蛋白，试图在不同水平阻断Notch信号通路以找出Notch和这些肿瘤之间的关系，实验证明通过对PSl和Notchl的干扰能引起细胞内Notch信号的下调，并造成肿瘤细胞的增殖抑制，而对正常细胞没有明显的影响。细胞周期检测发现增殖抑制的肿瘤细胞出现不同程度的G1/S阻滞，还发现肿瘤细胞的这种增殖抑制现象在不同细胞间也存在较大的差异，推测在不同细胞中存在着不尽相同的机制。最后选取皮下注射Hela细胞致瘤的裸鼠进行了裸siRNA瘤内注射的动物实验，成功抑制了肿瘤模型的生长，是为对Notch基因用于RNA干扰基因治疗的可行性研究的一次有益的尝试。 二、外源性Notchl胞内段的过表达对肿瘤生长的影响。 本节实验利用带有Notchl胞内活性部分(ICN)的重组逆转录病毒介导目的细胞过表达ICN，模拟细胞Notch途径上调的情况，实验中发现Notch信号的上调在不同肿瘤细胞中会引起不同的效应。在Hela和HepG2细胞的MTS检测中仍然出现增殖抑制，而在BGC-823细胞中，过表达的ICN则对细胞增殖起着促进作用。除此之外，差异还表现在细胞早期凋亡和细胞的周期检测上，Hela和HepG2检测不到早期凋亡的变化，而BGC-823可检测到一定程度的早期凋亡；Hela和HepG2在细胞周期检测中出现了明显的G1/S阻滞现象，而BGC-823则表现为S期细胞显著增加。在对Notchl和PSl的相关性进行进一步研究时，发现Notchl的过表达能引起肿瘤细胞内PSl表达的下调，而对Notchl和PSl的干扰实验却都不能引起对方表达的变化，并且这一简单的反馈机制在正常的永生化细胞中检测不到，推测这一调节机制很可能仅存在于肿瘤细胞系中，其中的机制影响着Notch信号传导途径对肿瘤细胞和非肿瘤细胞的不同作用。 三、可调控RNA干扰载体的构建与功能研究。 利用PCR的方法从pGL3-TRTP载体上扩增TRTP413启动子片断，并替换pBSl85 CRE蛋白表达载体上的CMV启动子，构建TRTP-CRE表达载体。利用受CRE重组调控的RNA干扰载体pSico和pSicoR构建针对GAPDH和Notchl的shRNA表达载体：pSico-GAPDH、pSicoR-GAPDH、pSico-Notchl和pSicoR-Notchl。实验证明经改造的pBSl85载体具有足够的CRE表达活性，能启动pSico(R)载体中的CRE-LoxP重组使RNA干扰的有条件发生，并能通过有效地启动或关闭Notchl shRNA的表达下调或上调细胞内的Notch信号，进而引起肿瘤细胞增殖情况的变化。

目录

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摘要

第一部分RNA干扰阻断Notch途径对肿瘤生长的影响

第二部分外源性Notch1胞内段的表达对肿瘤生长的影响

第三部分可调控RNA干扰载体的构建及功能研究

结论

参考文献

已刊文章目录

附录：综述 Notch信号传导系统与宫颈癌细胞系的增殖调控

致谢