肿瘤抑制基因lgl/dlg/scrib在果蝇卵子发生中的作用及其机制的研究

摘要

果蝇卵子发生涉及多个重要的生物学过程，如细胞命运决定与分化、细胞增殖、迁移、形变及细胞间通讯等。利用果蝇卵巢组织探查卵子发生及其内在调控机制一直是发育生物学的前沿和热点研究领域之一。在卵子发生早期茎细胞的分化将诱导卵母细胞定位于新生卵室后端并由此确立卵室最初的前后不对称性。随着卵子发生进行到中期，包裹生殖细胞的单层滤泡上皮细胞将沿卵室的前后轴方向分化为五类细胞亚群，即边界细胞、拉伸细胞、向心细胞、主体细胞和后端滤泡细胞。与此同时，分化后的后端滤泡细胞将指导卵母细胞体轴极性的建立。随后，在卵子发生9-10b期所有分化的滤泡上皮细胞将经历一系列显著的早期形态发生过程，此过程中涉及了细胞的主动迁移，细胞形状的改变及细胞集团性运动等事件。一系列研究表明，EGFR、JAK/STAT及Notch等多条信号通路从时空上精细调控滤泡上皮组织的细胞命运决定、分化以及早期形态发生过程。
　　 随着对果蝇卵子发生过程研究的逐步深入，已经鉴定出越来越多的功能基因或信号通路对该过程中多种生物学事件有重要的调控作用。而已有证据表明一组癌性肿瘤抑制基因lethal(2)giant larvae(lgl)，discs large(dlg)和scribble(scrib)是卵子发生过程中的功能必需基因，但其调控的具体环节及作用机制尚不清楚。本论文基基因，但其调控的具体环节及作用机制尚不清楚。本论文基于前人工作提供的线索首次研究发现lgl/dlg/scrib突变将造成后端滤泡细胞分化异常，并由此在卵子发生中期导致卵母细胞体轴极性建立的缺陷。该组基因对后端滤泡细胞分化的调控作用是通过影响EGFR、Notch和JAK/STAT信号通路活性或其正常功能的执行来实现的。进一步的遗传分析实验表明，lgl、scrib与dlg在以上过程中存在遗传互作，据此推断三者通过一条共同的途径来调节后端滤泡上皮细胞的分化过程。本论文通过研究lgll/dlg/scrib突变克隆还发现，该组基因功能丧失可在一定程度上干扰前端滤泡上皮细胞亚群，如拉伸细胞和向心细胞的分化及早期形态发生，其分子调节机制仍有待进一步揭示。有趣的是，该组基因在调控前端滤泡上皮细胞另一亚群边界细胞分化上存在明显的差异：dlg/scrib突变几乎不影响边界细胞的分化，但lgl是边界细胞分化所必需的。进一步的实验结果提示，lgl通过调节边界细胞中Notch信号通路的活性来实现上述功能。本论文还探讨了lgl在边界细胞迁移中的作用及其相关机制。结果表明lgl突变导致边界细胞团在定向迁移中发生解聚，突变型边界细胞中的极性蛋白定位及黏附分子聚集出现异常。我们据此认为，lgl在维持迁移中边界细胞团的完整性上发挥了重要作用，这一功能可能是通过调控细胞极性及细胞黏附来实现的。
　　 本论文研究还发现在卵子发生早期，成体细胞中的lgl是茎细胞正常分化所必需的。lgl突变将通过破坏茎细胞的正常分化从而影响卵母细胞定位于新生卵室后端的过程，进而干扰卵室初始前后不对称性的建立。
　　 本论文首次阐述了果蝇肿瘤抑制基因lgl/dlg/scrib在卵子发生中期调控滤泡上皮组织各亚群细胞分化及早期形态发生的重要作用，并探索了该组基因调节各亚群细胞命运决定作用的信号机制。接着我们通过遗传学实验发现该组基因在调节后端滤泡上皮细胞分化上存在遗传互作，并推测它们是通过同一条途径来参与调控上述生物学过程的。此外我们也首次发现lgl在调节茎细胞分化及新生卵室前后不对称性建立中的重要作用。总之，本论文研究不仅有助于加深我们对果蝇卵子发生这一受众多因素精细调控的生物学过程的理解，还为深入探究lgl/dlg/scrib如何调节细胞命运决定和分化、细胞迁移、上皮细胞极性及细胞增殖等基本生物学问题开辟了一条新的路径。

目录

文摘

英文文摘

上海交通大学博士学位论文答辩决议书

缩写及符号

第一章 引言

1.1 果蝇的卵子发生

1.2 极细胞、茎细胞的分化

1.3 滤泡上皮组织各细胞亚群的分化、早期形态发生及其调节机制

1.4 癌性肿瘤抑制基因lgl/dlg/scrib在上皮组织中的功能

1.5 lgl/dlg/scrib在果蝇卵子发生中功能的研究现状

1.6 本论文的研究目的、内容和意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 果蝇品系

2.1.2 抗体及荧光染料

2.2 实验方法

2.2.1 果蝇遗传学技术

2.2.2 果蝇卵巢组织间接免疫荧光染色

2.2.3 图像采集及处理

2.2.4 生物统计分析方法

第三章 实验结果

3.1 lgl/dlg/scrib 调控滤泡上皮细胞的命运决定、分化及早期形态发生

3.1.1 lgl/dlg/scrib 调控后端滤泡细胞的分化和功能

3.1.2 lgl/dlg/scrib调控后端滤泡细胞命运决定的信号机制

3.1.3 lgl/dlg/scrib调控前端滤泡细胞的分化及早期形态发生

3.1.4 lgl是边界细胞迁移及维持移动中边界细胞团完整性所必需的

3.1.5 lgl/dlg/scrib在调节后端滤泡细胞分化上存在遗传互作

3.1.6 总结

3.2 lgl对卵室前后不对称性及茎细胞分化的调节

3.2.1 lgl不参与对卵母细胞命运决定的调节

3.2.2 滤泡细胞中lgl的突变导致卵室初始前后不对称性的异常

3.2.3 lgl是形成卵母细胞与后端滤泡细胞间黏附所必需的

3.2.4 lgl突变导致茎细胞分化异常并因此影响卵室前后不对称性的建立

3.2.5 总结

3.3 结论

第四章 讨论

4.1 lgl/dlg/scrib在调控滤泡细胞分化上的前后端差异

4.2 lgl/dlg/scrib对Notch及JAK/STAT信号通路活性的调控

4.3 lgl/dlg/scrib可能参与对信号通路下游靶基因的转录调控

4.4 lgl/dlg/scrib与Hpo信号通路在调控滤泡上皮细胞分化上的异同

4.5 dlg调控卵母细胞体轴建立的特殊性

4.6 生理状态下迁移细胞中细胞粘附的维持需要dlg的参与

4.7 总结和展望

第五章 附录

5.1 利用酵母双杂交系统研究蛋白质问相互作用

5.2 酵母双杂交筛选系统材料与方法

5.3 筛选与Scrib存在蛋白质问相互作用的因子

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文