云杉卷叶蛾抗冻肽基因的合成及其在转基因拟南芥中的功能鉴定

摘要

植物在其整个生活周期中,无时不处于变化着的环境中。干旱、高盐和低温是诸多非生物逆境中对作物危害最为严重的自然灾害,长期以来,人们都非常关注对这种非生物胁迫的研究。通常在逆境条件下,植物能感知,传递逆境胁迫信号,诱导相关功能基因的表达,在生理生化上作出适应性响应.植物在生长发育过程中,需要对各种逆境和发育信号作出反应,这就要求对各种功能基因的表达进行精确调控。植物在感受环境胁迫信号后,会激活相应的信号传导途径,诱导大量胁迫应答基因表达,产生相应的胁迫应答反应。
　　 本研究利用基于PCR的两步PTDS方法(PCR-based two-step DNA synthesis,PTDS)技术成功的合成了来源于昆虫云杉卷叶蛾的抗冻肽基因CFAFP2I,CFAFP3I,CFAFP4I和CFAFP5I。PTDS基因合成方法,是一个较为简单,高效,高保真度,低成本的基于两步PCR方法合成长DNA序列方法。同以前的合成方法比较,该PTDS还具有时间短,通常是6到7天,该方法还比较容易获得不同种类,不同长度,甚至大于6kb的DNA片段,适合高GC比,高度重复序列,复杂二级结构的DNA合成.因而,PTDS方法提供了一个能够合成不同种类、具有复杂结构的长片段基因的可行的技术。
　　 为了进一步分析CFAFP2I,CFAFP3I,CFAFP4I和CFAFP5I基因的功能,本研究构建了衣杆菌—植物双元表达载体,通过蘸花法转化拟南芥,获得转CFAFP2I,CFAFP3I,CFAFP4I和CFAFP5I基因的拟南芥植株,结果表明,过量表达CFAFP3I基因的拟南芥提高了植物的抵抗低温的抗性,通过检测野生型和转CFAFP3I基因的拟南芥的电导率、脯氨酸、丙二醛和可溶性糖含量等多种生理指标,更进一步验证了过量表达该基因提高了植物耐低温的抗性。同时表明,同类型的基因即使序列很相似,但功能却未必相同的,本研究中,CFAFP2I与CAFAP3I基因的序列长度一样,相似性也很高,但是CAFP2I,CFAFP4I和CFAFP5I基因的转基因拟南芥的抗寒性没有得到提高.