鳜鱼蛋白酶原与胃质子泵基因的时空表达研究

摘要

胃蛋白酶(Pepsin)是胃中最重要的消化性蛋白酶，属于天冬氨酸蛋白酶家族，主要负责食物蛋白质的初步水解。胃腺分泌的胃蛋白酶原(Pepsinogen)是胃蛋白酶的无活性前体，在胃酸形成的胃部酸性环境下被激活，成为有活性的成熟的胃蛋白酶。胃质子泵(gastricprotonpump)，即胃H+/K+-ATPase，是胃酸分泌的关键性酶，是由α亚基和β亚基组成的异二聚体。α亚基负责催化和转运H+、K+，β亚基起稳定α亚基和辅助泌酸的作用。因此，胃蛋白酶和胃酸共同构成胃中蛋白质的酸性消化方式。在鱼类个体发生早期，胃腺的分化、胃蛋白酶原和胃酸的分泌都是具有重要意义的事件，前者标志着胃形态发育的完善，后者则意味着胃功能发育的成熟。所以，胃蛋白酶原和胃质子泵基因的表达可以作为胃分化和功能完善的分子标志。
　　 本研究首先利用RT-PCR(反转录PCR)和RACE(cDNA末端快速扩增)技术获得了鳜胃质子泵α亚基和β亚基的全长cDNA序列。α亚基全长3581bp，包括178bp的5'端非翻译区(UTR)，3069bp的开放阅读框(ORF)编码1022个氨基酸和334bp的3’UTR。β亚基全长1669bp，包括220bp的5’UTR和573bp的3'UTR，876bp的ORF共编码291个氨基酸。氨基酸序列分析显示胃质子泵α亚基具有10个跨膜结构域，第374-380氨基酸残基(DKTGTLT)是E1-E2型ATP酶磷酸化位点，N端18-28氨基酸残基(KKKKKKKMKKK)具有赖氨酸/甘氨酸簇结构，这一结构是α亚基的保守区域，在不同种属动物间同源性较高。胃质子泵β亚基仅有1个跨膜结构域，含有7个潜在的糖基化位点和3个二硫键。胃质子泵氨基酸序列比对和相似性分析显示了脊椎动物胃质子泵α亚基的高度保守性以及β亚基的相对可变性。
　　 为了阐明胃蛋白酶原和胃质子泵基因的时空表达特征，以及鳜个体发生早期胃蛋白酶原和胃质子泵基因的协同表达作用，根据本实验室前期获得的鳜3种胃蛋白酶原(PGA1、PGA2、PGC)以及本实验中获得的鳜胃质子泵基因cDNA序列，设计特异性的引物和地高辛标记RNA探针，用于RT-PCR和ISH(原位杂交)试验。RT-PCR研究表明，随着胃的发育(0-40dph，孵化后0-40天)，鳜3种胃蛋白酶原和胃质子泵基因依次表达。PGA1基因于4dph开始微弱表达，先于胃腺的出现；PGA2和胃质子泵α、β亚基转录本在12dph同时出现；PGC的转录本于14dph被检测到，与此同时，胃粘膜层中的胃腺细胞首次出现。原位杂交结果表明，鳜成体胃粘膜和个体发生早期各阶段仔、稚鱼的3种胃蛋白酶原和胃质子泵基因的表达均仅限于胃腺细胞中，表明鳜胃腺细胞同时具有分泌胃蛋白酶原和胃酸的功能，属于泌酸胃酶型细胞。鳜3种胃蛋白酶原和胃质子泵基因的显著表达均在12-14dph，且均在胃粘膜层的泌酸胃酶细胞中表达，表现出二者之间明显的时间和空间协同表达关系。此外，10dph的仔鱼胃粘膜中未发现胃腺细胞，胃粘膜中的胃腺细胞从14dph到40dph开始出现且数量逐渐增加。HE染色和原位杂交结果还表明，在鳜胃粘膜层中存在另外2种细胞类型：表面粘膜细胞和粘膜颈细胞，但此2种细胞中都没有胃蛋白酶原或胃质子泵基因的表达。
　　 本研究首次获得了鳜胃质子泵α、β亚基的全长cDNA序列，分析了序列特征；揭示了鳜个体发生早期3种胃蛋白酶原和胃质子泵的次序表达；明确了鳜发育早期胃蛋白酶原、胃质子泵基因的协同表达关系；确定了鳜胃蛋白酶原和胃质子泵基因的细胞表达定位和鳜胃腺细胞类型(泌酸胃酶细胞)；丰富了鱼类消化生理学的相关知识；加深了对鳜仔稚鱼消化系统早期发育过程的认识，为鳜的仔稚鱼培育和养殖管理提供了参考。