三种海水鱼类MHC基因多态性及半滑舌鳎家系构建与选育

摘要

本研究中，我们用一个感染性很强的细菌感染大菱鲆(Scophthalmusmaximus)，来研究它的主要组织相溶性复合体(MHC)ⅡB类基因的遗传变异情况。从6个大菱鲆家系中每个家系取100尾鱼苗用来注射爱德华氏菌悬液，家系的死亡率范围为28％到83.33％。每个家系选取5个存活个体和5个死亡个体，利用克隆和直接测序的方法来扩增大菱鲆MHCⅡB基因的第二外显子和第一内含子。从60个体中获得37个序列代表37个等位基因，其中25个等位基因是本研究中第一次发现，25个等位基因属于16个等位基因主型，选择8个等位基因来进行等位基因与抗病性/易感性间的关联性研究。在研究的每一个体中存在5个等位基因表明在大菱鲆中至少存在有3个位点或者拷贝的MHCⅡB基因。在全部家系数据中多肽结合区的非同义替换率是同义替换率的2.298倍，而在非多肽结合区非同义替换率是同义替换率的1.58倍，这些研究结果表明平衡选择在大菱鲆MHCⅡB基因的第二外显子中起作用。Scma-DBB1*02等位基因在存活个体中出现的频率要显著高于死亡个体中出现的频率(P=0.001＜0.05)，表明这个等位基因与大菱鲆抗爱德华氏菌病有关;而Scma-DBB1*10等位基因在死亡个体中出现的频率要显著高于存活个体中出现的频率(P=0.021＜0.05)，表明这个等位基因与大菱鲆对爱德华氏菌敏感相关。
　　在脊椎动物细胞表面糖蛋白的Ⅰ类和Ⅱ类分子上的MHC基因以高水平的多态性著称。先前的研究发现，在牙鲆(Paralichthys olivaceus)中Paol-DAB*4301等位基因与抗鳗弧菌病相关，并且在牙鲆G1代中抗病家系0768和0751中出现的频率很高。为了研究Paol-DAB*4301等位基因在牙鲆后代个体中的遗传变异情况，利用鳗弧菌液对7个牙鲆家系的700个体进行感染实验，发现在这些家系中有不同的死亡率。从7个牙鲆家系的每个家系中各选取5-10个存活及死亡个体通过多聚酶链式反应(PCR)和直接测序的方法来研究它们的MHCⅡB类基因的外显子2序列。发现116个不同的外显子2序列并且代表116个不同的等位基因，显示出在牙鲆的MHCⅡB类基因的外显子2至少存在4个位点。14个等位基因在同一个家系中的存活个体和死亡个体出现的频率不同但不具有显著性。在MHC基因的多肽结合区(PBR)的非同义替换与同义替换的(dN/dS)比率是6.234，表明平衡选择在MHCⅡB类基因中起作用。Paol-DAB*4301等位基因在家系101、家系104、家系92、家系102中都出现，而另一个等位基因Paol-DAB*0101也在家系101、家系104、家系41、家系102中出现。家系5是在G2代中最抗病的家系并且在MHCⅡB基因上具有最低的杂合度。在家系101中，等位基因Paol-DAB*4301在存活个体中出现的频率是11.2％而在死亡个体中出现的频率是4.8％并且两个频率间具有显著性差异(p=0.001＜0.05);在家系104中，等位基因Paol-DAB*4601在本研究中首次发现并且在存活个体中出现的频率(13.6％)要显著高于在死亡个体中出现的频率(6.5％，p=0.001);在家系41中，等位基因Paol-DAB*3803在存活个体中出现的频率(26％)要显著高于死亡个体中的频率(8％、p=0.01)。研究结果表明Paol-DAB*4301、Paol-DAB*4601、Paol-DAB*4302、Paol-DAB*3803、Paol-DAB*4101等位基因与牙鲆抗鳗弧菌病相关而Paol-DAB*2201、Paol-DAB*0301等位基因与牙鲆易感鳗弧菌病相关。
　　利用多聚酶链式反应(PCR)和直接测序的方法对10个半滑舌鳎家系中MHC基因位点遗传变异和平衡选择情况进行了研究。通过PCR方法扩增了半滑舌鳎MHCⅡB基因大约397 bp片段，这部分包含第一外显子的一部分，第一内含子的全部和第二外显子的全部。在10个半滑舌鳎家系中，每个家系中选取5个个体，每个体中选取5个克隆进行MHCⅡB基因序列分析。在50个体中发现60个不同序列代表60个等位基因，其中有28个序列是新发现的并递交到GenBank。同源分析表明60个序列相似性为89.36％。在6个个体中每个体发现有5个不同的序列，表明在半滑舌鳎个体中至少存在3个位点或者拷贝;在9个家系的个体中MHCⅡB序列多肽结合区(PBR)的错义替换(dN)显著高于同义替换(dS)。
　　组织相容性复合体(MHC)基因产物参与呈递外源多肽给T细胞从而在先天性免疫和适应性免疫中具有重要的作用。我们研究了经过鳗弧菌感染后的半滑舌鳎MHC classⅡB基因的遗传变异情况。来自于12个半滑舌鳎家系的2400尾鱼苗用来进行鳗弧菌（Vibrio anguillarum）感染。为了研究等位基因和抗性/易感爱德华氏菌病间的相关性，从4个抗病家系(HR，＜40.55％死亡率)和易感家系(LR，＞73.27％死亡率)中选出160尾个体进行MHCⅡB基因的exon2序列分析。半滑舌鳎MHCⅡB基因的exon2序列间显示出高度的多态性并且发现至少存在有4个位点。同时，多肽结合区的dN/dS值（非同义替换与同义替换的比值）要高于非多肽结合区的dN/dS值。在160个体中发现有88个等位基因，其中的13个等位基因用于抗病家系和易感家系中进行分布模式分析。特定的等位基因在抗病家系和易感家系中出现的频率是不同的，或者是只在抗病家系或者只在易感家系中出现。5个等位基因Cyse-DBB*6501、Cyse-DBB*4002、Cyse-DBB*6102、Cyse-DBB*5601和 Cyse-DBB*2801发现与半滑舌鳎易感鳗弧菌病相关并且在抗病家系中出现的频率分别为1.25％、1.25％、1.25％、1.25％和2.5％，在易感家系中出现的频率分别为35％、33.75％、27.5％、16.25％、15％(p=0.000、0.000、0.000、0.001、0.009)。4个等位基因Cyse-DBB*3301、Cyse-DBB*4701、Cyse-DBB*6801和Cyse-DBB*5901发现与半滑舌鳎抗鳗弧菌病相关，这4个等位基因在抗病家系中出现的频率分别为13.75％、11.25％、11.25％、8.75％并且在易感家系中出现的频率分别为1.25％、1.25％、1.25％、1.25％和1.25％(p=0.005、0.018、0.018和0.064)。本研究阐明MHCⅡB基因的作用将有助于半滑舌鳎分子标记辅助选择育种的深入发展。
　　以半滑舌鳎渤海野生群体和人工养殖群体为基础群体，建立了半滑舌鳎家系18个。对不同家系鱼苗进行荧光标记后放在同池进行生长比较，表明不同家系鱼苗生长速度差异显著，筛选出生长快速的家系2个（家系15和16号），生长较快的家系4个（家系6号、7号、16号和30号），生长速度一般的家系12个（家系1号、3号、4号、10号、12号、14号、19号、24号、27号、28号、33号和34号）。利用鳗弧菌感染其中12个家系，结果显示，2号家系感染后的成活率为79.25±45.19，被认作抗病力强家系;2个家系（12号和14号）感染后的成活率为50％-60％，被认作抗病力较强家系;6个家系（3号，6号，7号，10号，16号和19号）成活率为35％-50％，被认作抗病力一般的家系;3个家系(15号、27号和30号)的成活率在35％以下，被认作抗病力差的家系。本研究结果表明通过家系选育方法可以筛选出生长速度快、抗病力强的半滑舌鳎优良家系，从而为半滑舌鳎高产、抗病优良品种培育提供了物质基础。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1 适应性免疫和获得性免疫

2 主要组织相容性复合体(MHC)

2．1 主要组织相容性复合体(MHC)的发现及研究历史

2．2 鱼类MHC分子结构和功能

2．3 鱼类MHC Ⅰ类基因的研究

2．4 鱼类MHC基因用于系统进化研究

2．5 鱼类MHC基因全长序列已经报道的种类

2．6 鱼类MHC多态性研究的种类

2．7 鱼类MHC基因表达研究过的种类

2．8 鱼类MHC基因多态性与抗病／易感相关性研究

2．9 鱼类MHC基因中变异的选择机制

2．10 MHC克隆过程中可能产生的错误

2．11 鱼类MHC基因的命名规则

2．12 MHC的研究趋势

3 本研究论文的目的与意义

第二章 6个大菱鲆家系中MHC多态性和抗爱德华氏菌病研究

1 前言

2 材料和方法

2．1 大菱鲆家系建立和培育

2．2 感染实验

2．3 取样和DNA的提取

2．4 引物设计和多聚酶链式反应(PCR)扩增

2．5 克隆和测序

2．6 氨基酸序列分析和比对及统计检验

3 结果

3．1 6个大菱鲆家系的抗病／易感性比较

3．2 MHC Ⅱ B基因的exon 2序列多态性分析

3．3 MHC Ⅱ B等位基因和对爱德华氏菌抗病／易感性相关性分析

4 讨论

第三章 7个牙鲆(Paralichthys olivaceus)家系MHC基因多态性和平衡选择研究

1 前言

2 材料和方法

2．1 实验设计

2．2 感染实验

2．3 取样和分离DNA

2．4 引物设计和聚合酶链式反应(PCR)

2．5 克隆及测序

2．6 基因分型，序列分析和统计检验

3 结果

3．1 MHC ⅡB类序列多样性

3．2 7个牙鲆家系中等位基因的分布

3．3 7个牙鲆家系中存活及死亡个体中等位基因频率及对爱德华氏菌抗性／易感性相关性

3．4 正向选择的证据

3．5 等位基因在下一代中的遗传

4 讨论

第四章 8个半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)家系的MHC多态性和抗鳗弧菌病间相关性研究

1 前言

2 材料和方法

2．1 实验鱼饲养

2．2 感染实验

2．3 取样及DNA提取

2．4 引物设计和多聚酶链式反应(PCR)

2．5 克隆和测序

2．6 基因型，序列分析和统计检验分析

3 结果

3．1 在8个半滑舌鳎家系中比较抗病／易感性

3．2 MHC ⅡB等位基因和抗／易感鳗弧菌病间的相关性

4 讨论

第五章 10个半滑舌鳎家系MHC基因多态性和平衡选择作用研究

1 前言

2 材料和方法

2．1 实验鱼

2．2 取样及DNA提取

2．3 引物设计和多聚酶链式反应(PCR)

2．4 克隆和测序

2．5 基因型、序列分析和统计检验分析

3 结果

3．1 10个半滑舌鳎家系中MHC Ⅱ类第二外显子序列的多态性

3．2 半滑舌鳎MHC ⅡB基因选择作用

4 讨论

第六章 半滑舌鳎家系建立及其生长和抗病性能测定

1 前言

2 材料与方法

2．1 半滑舌鳎野生群体收集和人工养殖群体建立

2．2 精、卵采集与人工授精

2．3 半滑舌鳎家系建立

2．4 半滑舌鳎家系苗种培育

2．5 半滑舌鳎家系鱼苗荧光标记及混养

2．6 半滑舌鳎不同家系鱼苗生长性能测定

2．7 半滑舌鳎不同家系鱼苗抗鳗弧菌病能力的测定

2．8 统计分析

3 结果

3．1 半滑舌鳎不同家系鱼苗的生长性能比较

3．2 半滑舌鳎不同家系鱼苗的抗病性能

4 讨论

小结

参考文献

致谢

博士在读期间完成的论文