猪瘟口服疫苗保护剂筛选及免疫效果评价

摘要

猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病。该病呈急性或慢性感染，在许多国家和地区均有发生，给养猪业造成极大的危害。目前，疫苗接种仍是控制猪瘟疫情的主要手段。现阶段我国使用的猪瘟疫苗主要有猪瘟兔化弱毒株、家兔脾淋组织苗、乳猪肾细胞苗等注射型疫苗。国外报道猪瘟疫苗口服免疫获得了很好的效果，经口服免疫，可减少对猪只的应激且省时省力。因此研究拟通过筛选理想的保护剂，制备可经口服途径免疫的猪瘟疫苗。
　　本研究采用两种方法制备口服抗原：以猪瘟病毒疫苗株与重组LTRG蛋白及冻干保护剂配伍，制备冻干抗原；另外利用壳聚糖-海藻酸钠包埋重组CSFV E2蛋白，制备微囊抗原；两种抗原分别口服饲喂小鼠，以细胞免疫指标和体液免疫指标评价抗原的免疫效果，筛选理想的抗原保护剂。
　　1.蛋白抗原包埋及免疫活性检测
　　构建CSFV E2基因的原核表达质粒并表达蛋白，经纯化后将其作为抗原，与黏膜佐剂蛋白LTRG共同包埋制备壳聚糖-海藻酸钠微球，然后口服免疫小鼠，检测其免疫效果。结果，包埋E2和LTRG蛋白组小鼠的血清IgG和黏膜IgA水平均显著高于对照组，高于E2蛋白包埋组，表明LTRG蛋白作为一种黏膜佐剂，增强了小鼠的免疫反应。此外，包埋E2和LTRG蛋白组小鼠的抗体水平显著高于E2+LTRG蛋白组，说明壳聚糖-海藻酸钠微球作为包埋载体，将抗原进行了有效的呈递，从而诱导小鼠产生免疫反应。
　　2.冻干保护剂筛选及免疫效果评价
　　研究配比了不同组分的冻干保护剂，包括明胶、乳糖和甘氨酸，与黏膜佐剂LTRG蛋白、CSFV按比例混合，经优化冻干工艺后，制备了4种CSFV的冻干苗。口服免疫小鼠，测定血清IgG和黏膜IgA抗体效价。结果，含明胶和甘氨酸的试验2组和含明胶的试验4组经冻干后外观形态较好，水溶后呈现澄清状态；试验2组和试验4组的冻干苗经口服免疫，诱导小鼠产生的IgG抗体水平极显著高于CSFV组、CSFV+LT组及其他试验组；二免7天后试验2组小鼠产生的IgA抗体极显著高于其他组。而且，试验2组小鼠脾脏的IFN-γ和IL-4细胞因子的表达量也极显著高于其他组。表明，在冻干过程中，明胶和甘氨酸对猪瘟病毒起到了良好的保护作用，提高了猪瘟病毒疫苗经口服途径的免疫效果。
　　利用壳聚糖-海藻酸钠包埋制备重组蛋白微球抗原，能诱导机体产生良好的体液免疫反应和细胞免疫应答，证实包埋蛋白抗原具有良好的免疫效果。配伍不同组分的猪瘟病毒疫苗保护剂，制备的冻干疫苗，能有效提高机体免疫抗体水平，证实制备的冻干保护剂配方对猪瘟病毒有较好保护作用。本研究为猪瘟疫苗冻干保护剂筛选和不同剂型疫苗的开发奠定了基础。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章猪瘟疫苗及冻干保护剂概述

1猪瘟病毒概述

2猪瘟疫苗简介

2.1猪瘟灭活苗

2.2猪瘟弱毒苗

2.3基因工程亚单位疫苗

2.4病毒活载体疫苗

2.5猪瘟病毒核酸疫苗

2.6猪瘟病毒全长感染性cDNA标记疫苗

2.7猪瘟口服疫苗

2.8小结

3疫苗冻干保护剂

3.1冷冻干燥特点

3.2冻干保护剂

3.3总结

第二章猪瘟口服蛋白抗原制备及免疫活性检测

1材料

1.1质粒与毒株

1.2主要试剂

1.3主要仪器

1.4溶液的配制Urea-NTA0 (1L)

1.5引物设计

2试验方法

2.1 CSFV E2基因的克隆与表达

2.2 E2蛋白的纯化

2.3包埋蛋白抗原的制备

2.4小鼠口服免疫试验

3结果

3.1 CSFV E2蛋白的表达与纯化结果

3.2免疫小鼠血清IgG抗体水平检测

3.3免疫小鼠IgA抗体水平检测

3.4 IFN-γ表达量检测

3.5 IL-4表达量检测

3.6 IL-2表达量检测

3.7 IL-6表达量检测

4讨论

第三章猪瘟病毒疫苗冻干保护剂的筛选及免疫活性检测

1材料

1.1细胞株、毒株

1.2主要试剂

1.3主要仪器

1.4引物的设计与合成

2.试验方法

2.1 CSFV的增殖及TCID50的测定

2.2样品的冻干及特性检测

2.3小鼠口服免疫试验

3结果

3.1猪瘟病毒的增殖及TCID50测定结果

3.2冻干制品的特性检测结果

3.3小鼠血清IgG抗体水平检测

3.4小鼠黏膜IgA抗体水平检测

3.5脾脏IFN-γ表达量检测

3.6脾脏IL-4表达量检测

3.7胸腺IFN-γ表达量检测

3.8胸腺IL-4表达量检测

4讨论

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士期间论文发表情况