红螯光壳螯虾（Cherax quadricarinatus）卵黄发生的研究

摘要

红螯光壳螯虾又称澳洲淡水龙虾，原产于澳大利亚。该虾具有个体大、生长快、食性杂、适应性强、可纯淡水繁殖等诸多优点。至八十年代末，红螯光壳螯虾已多个国家和地区引进试养。我国自1992年引入，虽有少量成功养殖的报告，但在生产上还未形成规模化养殖，还有较多如亲虾卵子成熟同步率差异、产卵量、孵化率和成活率较低等关键问题尚未解决。卵黄发生是甲壳动物卵母细胞发育成熟的必要条件，是雌性甲壳动物生殖周期的决定性时期，直接关系到胚胎发育过程中营养组分的分解利用。因此，卵黄发生的好坏影响到亲体的孵化率和胚胎发育的成活率，对于红螯光壳螯虾的繁殖和育苗有着重要的意义。本文在已有研究基础上，综合组织学、电镜技术、生化、酶学等研究方法，系统地研究了红螯光壳螯虾卵黄发生过程中卵黄的形成特点、参与的细胞器及其在整个过程中生理生化指标的变化。为甲壳动物卵黄发生的研究积累基础资料，同时为生产中提高红螫光壳螯虾繁殖及育成率提供理论支持。 ㈠红螯光壳螯虾卵黄发生期形态学研究。1.红螯光壳螯虾卵黄发生期卵巢显微与超微结构研究采用组织切片以及透射电镜技术研究红螯光壳螯虾卵黄发生期间卵巢组织形态学及超微结构变化。结果表明：红螯光壳螯虾卵黄发生具有双重来源，外源性卵黄较多。有多种细胞器参与卵黄发生：核糖体、内质网、高尔基体等具有较强合成作用的细胞器在早期内源性生成卵黄物质及卵黄颗粒前体，但在这类细胞器整个卵黄发生过程中数量较少。而参与外源性卵黄合成的细胞器数量较多且发达，溶酶体吞噬、溶解细胞内含物并与内质网等共同作用形成卵黄；大量的线粒体在整个过程中除了起到供能作用外，自身也参与卵黄颗粒的形成。虽然在卵黄发生的早期和中期有内源性卵黄发生，但在其卵黄发生过程中，特别是中、后期对卵黄形成和积累起主要作用的是外源性的卵黄合成；2.红螯光壳螯虾卵黄发生期肝胰腺显微与超微结构研究应用组织学方法和透射电镜技术对红螯光壳螯虾卵黄发生期间肝胰腺的组织形态学及超微结构变化进行研究。结果表明：肝胰腺管上皮细胞根据形态和功能分为R、F、B、E四种类型。在卵黄发生过程中，R细胞数量较多，其中R2细胞比例逐渐增多；在其细胞内内质网、线粒体、核糖体等胞器将吸收的物质合成、包装成卵黄蛋白原颗粒和脂滴。F细胞数量则是随着卵黄发生的进行逐渐减少，其内有较多的粗面内质网，也有较强的合成酶原颗粒功能。B细胞起吸收、消化和分泌的作用，内含一个大消化泡。E细胞在卵黄发生前期和中期主要分布在腺管边缘，不断分化、补充其他细胞的损耗。根据研究结果探讨了红螯光壳螯虾肝胰腺中的卵黄蛋白原颗粒和脂滴的形成方式、各种细胞在卵黄发生中的作用以及卵黄的来源问题，认为红螯光壳螯虾的卵黄发生以外源性卵黄发生为主。 ㈡红螯光壳螯虾卵黄发生期物质及能量代谢研究1.红螯光壳螯虾卵黄发生期生化组成变化采用生物化学方法测定了红螯光壳螯虾卵黄发生期间可溶性蛋白、脂类和水分含量以及氨基酸、脂肪酸的组成。结果表明：在肝胰腺中可溶性蛋白、脂类和水分含量随卵黄发生进行呈略有下降的趋势，变化量较小；在卵巢中可溶性蛋白在8期有较明显的上升，脂类含量在整个过程中上升趋势明显，水分含量则有一定下降。它们在各时期的变化体现了卵黄发生过程中物质利用和转移的特点随卵黄发生的进行，肝胰腺中氨基酸总量总体呈波动且略有下降趋势，但变化趋势不明显且变化幅度不大；卵巢中氨基酸总量随卵黄发生增多，各期差异显著。在肝胰腺及卵巢组织中共检测出17种氨基酸，其中必需氨基酸9种，非必需氨基酸8种。在所有氨基酸中，亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)在肝胰腺和卵巢中的含量均较高，卵巢中Lvs、Val也具有较高含量，其氨基酸变化与卵黄发生显著相关。随着卵黄发生进行，肝胰腺中饱和脂肪酸总量从1期35％左右下降至8期29％左右；单不饱和脂肪酸总量从1期30％左右上升至8期40％左右；多不饱和脂肪酸含量在整个过程中略有波动，但总量变化不大。其中，饱和脂肪酸(SFA)中的C16:0、单不饱和脂肪酸(MUFA)中的C18：ln9c和多不饱和脂肪酸(PUFA)中的C18:2n6c这3种脂肪酸在卵黄发生各阶段的肝胰腺中含量较高。卵巢中饱和脂肪酸总量下降显著，从1期48％左右下降至8期23％左右，下降了近25％：单不饱和脂肪酸总量从1期33％左右上升至8期49％左右，增长显著；与肝胰腺不同的是，卵巢中多不饱和脂肪酸含量在整个过程中有较显著的增长，从1期18％左右上升至8期的27％左右。卵巢中饱和脂肪酸中的棕榈酸(C16:0)；单不饱和脂肪酸中的棕榈油酸(C16:1)和油酸(18：lω09c)；多不饱和脂肪酸中的亚油酸(C18:2n6c)、EPA(C20:5n3)含量较高；2.红螯光壳螯虾卵黄发生期消化酶活性研究采用生物化学方法分别测定了红螯光壳螯虾卵黄发生各期的各种消化酶：脂肪酶、总脂酶954.4、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、类胰蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的比活力。结果显示：在整个卵黄发生过程中，肝胰腺内脂肪酶呈逐步升高后下落趋势；卵巢脂肪酶比活力较低，在整个过程中变化不大。总脂酶在肝胰腺和卵巢中的变化趋势均与脂肪酶相反。在肝胰腺中酸性磷酸酶活力1、2期最高，3期下降后略有波动；卵巢中酸性磷酸酶活力较弱。碱性磷酸酶在肝胰腺和卵巢中活力接近，只在第5期的肝胰腺中有明显的上升。肝胰腺中类胰蛋白酶呈明显的波动趋势；卵巢中类胰蛋白酶活力较肝胰腺低，呈略有上升趋势。肝胰腺中淀粉酶总体呈上升趋势，但有一定波动；卵巢中则是1至5期活力基本稳定，5至8期活力降低。纤维素酶在肝胰腺中活力较稳定，在卵巢中则在第2期达到最高峰后一直呈下降趋势。肝胰腺足甲壳动物最主要的消化腺，也是外源性卵黄发生的重要场所，因此其消化酶的变化能较好的反应出其在卵黄发生过程中消化生理的变化；卵巢是内源性卵黄发生的场所以及外源卵黄转移的目的地，相关酶活力的变化也反应了在合成过程中物质的代谢和转化。 ㈢红螯光壳螯虾卵黄发生期卵黄蛋白原及FaMet基因表达变化。1.红螯光壳螯虾卵黄发生各期卵黄蛋白原基因(Vg)的表达采用QRT-PCR方法检测红螯光壳螯虾卵黄发生各期肝胰腺和卵巢中卵黄蛋白原(Vg)mRNA的表达。结果显示：红螯光壳螯虾卵黄发生期间肝胰腺中卵黄蛋白原表达量呈上升趋势，第1、2期较低，第3期开始迅速升高，且上升趋势明显，在第5、第7期略有下降，至第8期达到最高值。而在卵巢中，卵黄蛋白原mRNA几乎无表达，只能检测到极少的量。从整个卵黄发生过程来看，肝胰腺是卵黄蛋白原的主要合成部位，而卵巢对其合成基本无贡献；2.红螯光壳螯虾卵黄发生各期FaMet基因表达变化FaMet是在法尼酯酸(FA)转化为甲基法尼酯(MF)过程中与最后一步有关的酶，对MF的研究表明FaMet与甲壳动物很多重要的生物功能有关，包括变态、繁殖和蜕皮。采用QRT-PCR方法检测红螯光壳螯虾卵黄发生各期肝胰腺和卵巢中FaMct mRNA的表达。结果显示：卵黄发生期间卵巢中FaMet的表达量有一定波动，第1期较低，第2至4期上升趋势明显，在第5至7期略有下降，至第8期再次升高。而在肝胰腺中，FaMet检测到的量也较少，在整个过程中表达量变化不大。FaMet在目标组织进行MF最后一步的转化还是编码了其他有关的蛋白，仍有待于进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章综述

第一节甲壳类动物卵黄发生研究概况

第二节本项研究的目的及意义

第二章红螯光壳螯虾卵黄发生的形态学研究

第一节红螯光壳螯虾卵黄发生期卵巢显微与超微结构研究

第二节红螯光壳螯虾卵黄发生期肝胰腺显微与超微结构研究

第三章红螯光壳螯虾卵黄发生期物质及能量代谢研究

第一节红螯光壳螯虾卵黄发生期生化组成的变化

第二节红螯光壳螯虾卵黄发生期消化酶活性的变化

第四章红螯光壳螯虾卵黄发生期卵黄蛋白原及FaMet基因表达变化

第一节红螯光壳螯虾卵黄发生各期卵黄蛋白原(Vg)基因的表达

第二节红螯光壳螯虾卵黄发生各期FaMet基因的表达

总结

参考文献

附录

致谢