核受体相关因子1的功能研究及其调控相关基因的筛选

摘要

多巴胺能神经元主要分布于中脑黑质(SN)和腹侧被盖区(VTA)，它在调节大脑多种复杂的生理功能中发挥着重要作用，包括随意运动以及奖赏、成瘾等动机行为，其功能异常与帕金森病(Parkinsondisease，PD)和药物成瘾(drugdependence／dragaddiction)等多巴胺系统疾病密切相关。从酪氨酸到多巴胺(Dopamine，DA)需要经过两个酶解过程，第一个限速酶为酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH)，它能将酪氨酸代谢为多巴胺前体L多巴，后者再经过芳香左旋氨基酸脱羧酶(AADC)代谢为DA。而L-多巴可以透过血脑屏障，并被内源性AADC代谢为DA，从而成为PD的主要治疗药物。核受体相关因子l(nuclearreceptor-relatedfactor1，Nurrl／NR4A2／NOT／RNR-1／HZF-3)是一种转录因子，与NGFI-B、Norl均属于核甾体／甲状腺激素受体超家族成员，它主要表达于中枢神经系统，特别是中脑黑质、腹侧被盖区以及边缘系统。最近有研究表明，Nurrl作为基因转录调控蛋白对DA能神经元的发育、迁移以及存活起关键作用。中脑黑质内Nurrl缺失或功能改变与PD相关，并与其他一些神经精神疾病如精神分裂症、躁狂、可卡因易感等有关。因此，Nurrl已被认为是PD和药物依赖等疾病的重要候选基因。然而，Nurrl在DA神经元发育分化中的调控机制还不清楚，它对DA能神经元表型标记物酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH)的调控作用以及促进DA能神经元的成熟方面仍存在争议。另外，我们的近期研究结果提示，GABA转运蛋白亚型1(GABAtransporter-1，GATl)在吗啡和酒精的依赖机制中可能发挥重要作用，但是其具体机制尚不清楚。已有研究表明Nurrl在酒精和可卡因的奖赏强化过程中起重要作用，因此，我们推测Nurrl可能在GATl导致的药物成瘾机制中起也起到类似的调节作用。 材料与方法：本实验共分三个部分，其中第一、第二部分为体外研究，分别按照如下步骤进行。(1)第一部分分三步进行：首先，利用RT-PCR方法对小鼠Nurrl基因进行克隆，然后将其亚克隆至pEGFP-C1质粒的多克隆位点中；其次，将经过酶切和测序证实正确的Nurrl表达质粒用LipofectamineTM2000转染至MN9D细胞中；最后，提取细胞mRNA和总蛋白并利用半定量RT-PCR、实时定量PCR以及免疫印迹技术分别检测Nurrl和THmRNA和蛋白的表达。同时，利用倒置荧光显微镜观察MN9D细胞的神经突起生长情况，并进行拍照。(2)第二部分亦分三步进行：首先，选择两段RNA干扰靶序列，合成两对编码发夹siRNA序列的单链寡核苷酸，并将其克隆到pSilenCircle载体中，构建含目的基因片段的重组质粒pSC-N1和pSC-N2以及无关基因作为阴性对照质粒，经过转化、扩增以及纯化后进行酶切和测序鉴定。其次，将经过酶切和测序证实正确的质粒用LipofcctamincTM2000转染至MN9D细胞中，并用13418筛选两周；最后，提取细胞mRNA和总蛋白并利用半定量RT-PCR、实时定量PCR以及免疫印迹技术分别检测Null和THmRNA和蛋白的表达。同时，利用倒置荧光显微镜观察MN9D细胞的神经突起生长情况，并进行拍照。(3)第三部分分两个过程：首先，为了进一步证实GATl基因同源重组的正确性，利用免疫印迹和免疫组化技术对9只GAT基因敲除小鼠(野生型、杂合子和纯合子各三只)海马GATl蛋白的表达进行了检测；其次，利用实时定量PCR和免疫组化技术检测9只GATl基因敲除小鼠(野生型、杂合子和纯合子各三只)纹状体和中脑内NullmRNA和蛋白的表达变化情况。(4)第四部分主要是利用Affymetrix寡核苷酸芯片来寻找MN9D细胞内受到Nulrl诱导而发生变化的基因。首先，常规培养实验组(Nurrl过表达MN9D细胞)和对照组细胞(用RNA干扰产生的Null下调MN9D细胞)，提取各组细胞总RNA并逆转录为cDNA。然后合成生物素标记的cRNA，并片断化。最后杂交、洗脱、染色、芯片扫描并利用GCOS软件进行数据分析。 结果：下列分别是三部分实验的结果：(1)酶切和测序鉴定证实Null真核表达载体构建成功，Null过表达MN9D细胞内NullmRNA和蛋白表达明显升高，同时THmRNA和蛋白表达也明显增高，而RTH升高程度更为显著。另外，Null过表达MN9D细胞的平均神经突起数目、平均神经突起长度和神经突起总长度均明显增加，提示Null可能诱导DA细胞以神经突起延长的特征的细胞成熟和形态分化。(2)酶切和测序鉴定证实Null和无关基因的shRNA表达载体构建成功；pSC-N1和pSC-N2可特异性抑制MN9D细胞中NuglmRNA的表达，下降率分别为62．3％和45．6％；并能使其下游基因THmRNA的表达明显下调，下降率分别为76．3％和62．6％。同时Null和TH蛋白表达亦明显下调，而RTH蛋白表达的下调更为明显。Nuffl和TH蛋白的下降率分别为57．4％、72．0％以及79．1％、70．1％。而阴性对照质粒和脂质体组对两者的mRNA和蛋白没有抑制作用。Nugl表达下调后MN9D细胞的神经突起数目和长度有所减少，但是无统计学差异。(3)GATl基因敲除杂合子和纯合子小鼠海马内GATl蛋白的表达缺失，而野生型小鼠海马内GATl蛋白表达正常存在，提示GATl基因同源重组正确。利用实时定量PCR检测发现，与野生型小鼠相比，杂合子和纯合子小鼠脑纹状体内NullmRNA表达明显增高(p<0．05)；与野生型和杂合子小鼠相比，纯合子小鼠中脑内NullmRNAR著升高(p<0．01)。免疫组化检测结果提示，与野生型小鼠相比，杂合子、纯合子小鼠纹状体区域Null免疫阳性细胞数显著增多(p<0．01)。杂合子和纯合子小鼠中脑黑质区域Null免疫阳性细胞数比野生型小鼠稍多，但是无统计学差异(p>0．05)。另外，纯合子小鼠中脑黑质以及杂合子小鼠纹状体区域Null免疫阳性细胞染色明显比野生型和杂合子要深。(4)基因芯片筛选结果发现，有80条基因表达上调、8条基因表达下调，它们主要编码信号转导蛋白、发育和分化相关蛋白、生物合成以及代谢相关蛋白、参与炎症反应和免疫应答蛋白、凋亡、内质网应激以及细胞周期蛋白等。另外，还有24调节基因编码未知功能蛋白。 结论：(1)MN9D细胞内过表达Nurrl能促进THmRNA和蛋白的表达，并能增加细胞神经突起的延长，提示Nurrl对多巴胺能神经元的发育具有关键作用，同时表明它在维持多巴胺能神经元的成熟中具有重要功能。由于DA能神经元能调节随意运动，其变性会导致PD的发生，因此Nurrl对DA能神经元的这种重要功能提示其在PD的基因治疗中具有潜在价值。(2)经过酶切和测序鉴定正确的pSC-N1、pSC-N2质粒能特异性地抑制NurrlmRNA和蛋白的表达，提示本实验成功地构建了NurrlshRNA的表达载体。同时，它能使TH的表达显著下调，提示Nurrl对多巴胺能神经元内TH的表达调控起关键作用。因此，NurrlshRNA特异性表达载体可能为进一步在体内研究PD以及多巴胺能神经元发育相关基因的功能提供新的有效的研究方法。(3)GATl基因敲除杂合子和纯合子小鼠脑部纹状体内NurrlmRNA以及蛋白的表达增强可能是对GATl表达缺失后导致的GABA失衡产生的一种保护性效应。Nurrl能加强酒精和可卡因依赖的强化特性中的奖赏机制，因此它可能在GATl相关的药物成瘾机制中发挥正向调节作用。此外，Nurrl可能是药物成瘾机制中DA系统和GABA系统之间的联络中介。(4)基因芯片结果提示，Nurrl可能参与了上述信号转导、分化与发育、生物合成与代谢等过程。尽管仍需要进一步实验加以证实，但是这些结果为我们提供了深入了解多巴胺细胞内Nurrl及其调控基因功能的线索。

目录

中英文缩略词

前言

第一部分 Nurr1过表达对多巴胺能细胞系MN9D细胞表型分化的影响

第二部分 Nurr1表达下调对多巴胺能细胞系MN9D细胞表型分化的影响

第三部分 Nurr1在Gat-1敲除小鼠脑内表达变化的初步研究

第四部分 cDNA微阵列筛选Nurr1调控相关基因的初步研究

全文总结

致谢

附录一 攻读博士学位期间发表的论文和会议摘要

附录二 攻读博士学位期间获得的奖励

附录三 文献综述

论文独创性声明及论文使用授权声明