正常人肝组织及肝癌转移相关核心岩藻糖基化蛋白质组学研究

摘要

糖蛋白质组学是研究糖蛋白表达谱、糖链组成及其功能的一门有发展前景的新学科。糖蛋白在细胞识别、粘附、细胞间相互作用等细胞功能中发挥了关键作用。许多疾病的发生与蛋白质糖链结构异常有关。至今仍没有一个完整数据库全面阐述正常生理状态下所有糖基化的蛋白质，也未见有系统的糖蛋白质组学手段筛查病理过程相关的异常糖基化蛋白质。由于α-1，6岩藻糖(又称核心岩藻糖)普遍存在于很多糖蛋白中，并且其糖基化程度异常与肝癌或慢性肝病的发生和诊断关系密切。本研究利用扁豆凝集素(LCA)对糖链内核心岩藻糖的高亲和性及适用于大样本的、高通量糖蛋白质组学共性技术平台，即凝集素亲和层析、双向电泳(2-DE)联合基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS／MS)分析，首次建立了正常人肝脏组织核心岩藻糖基化蛋白数据库。同时应用2-DE和凝集素印迹联合MALDI-TOF-MS／MS分析，对高低转移潜能不同人肝癌细胞系即高转移的MHCC97-H、低转移的MHCC97～L和基本不转移的Hep3B细胞进行研究，获得了它们的核心岩藻糖基化蛋白质修饰谱，发现膜联蛋白I(AnnexinI)、膜联蛋白II(AnnexinII)和细胞角蛋白8(CK8)等异常核心岩藻糖基化状态及差异性表达，分析了此种糖蛋白表达和糖链结构的改变与肝癌细胞系转移潜能的关系。 第一部分正常人肝组织核心岩藻糖基化蛋白质数据库的建立及生物信息学分析 本部分研究旨在建立适用于大样本、相对稳定、标准的高通量糖蛋白质组学共性技术平台，并以此为基础，建立正常人肝脏组织核心岩藻糖基化蛋白质数据库，为正常状态下，机体内糖蛋白的全面阐述提供基本生物学信息，为蛋白质核心岩藻糖基化在体内功能研究提供理论依据。 选择不同正常人的肝脏组织4例，提取总蛋白通过LCA亲和层析柱后，分成两个组份，柱不结合组分由非核心岩藻糖基化蛋白构成；柱结合组份由核心岩藻糖基化蛋白组成。两组份与总蛋白分别进行聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)，发现通过亲和层析使得LCA结合的低丰度糖蛋白得到富集。应用非线性pH3～10，长7cm的固定洲梯度的lPG胶条对它们进行2-DE分离，并结合蛋白银染技术，获得正常人肝脏组织核心岩藻糖基化蛋白表达谱，ImageMaster软件探测到蛋白质点130±3个，分析图谱发现LCA结合型糖蛋白较偏碱性端，PI7-10，MW26-50KD区域处有许多高丰度蛋白；同时从获得的总蛋白和非核心岩藻糖基化蛋白表达谱中，分别探测到蛋白质点650±20个和300±10个，它们分布情况相似，主要位于PI3-10，MW20～36KDa和PI7-10，MW26～60KDa区域处。切取正常人肝组织核心岩藻糖蛋白表达谱中90个蛋白点，应用MALDI-TOF-MS／MS进行鉴定，通过数据库搜索、分析比对及去冗余后，共鉴定53种蛋白。将实际鉴定的53种蛋白利用NetNGlyc1．0和NetoGlyc软件进行糖基化位点预测，发现除6个蛋白仅具有0-连接糖基化位点外，其他蛋白均含有潜在N-连接糖基化位点，但个数不一。按照GeneOntology三种分类方式对它们分类，细胞定位分类中位于细胞器的占LCA结合型糖蛋白的28％，其中，线粒体和内质网为最多；分子功能分类中具有结合活性和催化活性的蛋白分别占37％和30％；生物学功能分类中参与体内代谢过程的蛋白占33％。 第二部分人肝癌细胞系转移相关的核心岩藻糖基化蛋白质 组学研究 本部分研究旨在建立适用于小样本，高通量糖蛋白质组学共性技术平台。比较研究转移潜能不同人肝癌细胞系核心岩藻糖基化蛋白质表达谱，筛查与分析人肝癌细胞系转移潜能相关的异常糖基化蛋白质，为肝癌转移复发的预测及机制研究奠定理论基础，为疾病相关分子的糖蛋白质组学研究提供技术手段。 选择转移和非转移人肝癌组织以及转移潜能不同人肝癌细胞系Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H，提取总蛋白，进行SDS-PAGE和2-DE分离，结合LCA亲和印迹技术，建立LCA凝集素亲和印迹图谱，即核心岩藻糖基化蛋白表达图谱。发现组织和细胞内蛋白的核心岩藻糖基化程度随肝癌转移潜能的增加而增加，核心岩藻糖基转移酶基因的表达也相应增加。SDS-PAGE／LCA凝集素印迹图谱显示，MHCC97-H和MHCC97-L在35～45KDa和45～60KDa间出现了Hep3B未见的条带。Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H的2-DE／LCA凝集素印迹图谱中，分别平均检测到54±7个蛋白点(n=3)，59±6个蛋白点(n=3)，62±4个蛋白点(n=3)。以各自2-DE-考兰染色图谱为参考胶，利用ImageMaster软件对各细胞的核心岩藻糖基化蛋白表达图谱和总蛋白2一DE图谱进行匹配分析，Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H分别与其匹配的平均匹配点数为25±3个(n=3)，29±4个(n=3)，26±3个(n=3)，切取所有匹配蛋白点，应用KiLDI-TOF-MS／MS进行鉴定，通过数据库搜索共鉴定34种蛋白。 比较糖蛋白质组学分析发现AnnexinI、CK8等7种差异分布蛋白质的异常核心岩藻糖基化状态可能与人肝癌细胞系转移潜能相关。并对AnnexinI，AnnexinII和CK8异常核心岩藻糖基化再验证，经LCA亲和沉淀提取的糖蛋白中，AnnexinI在~ff[CC97-H中的表达水平较MHCC97-L高，而Hep3B中几乎不表达；AnnexinII和CK8在MHCC97-L和MHCC97-H中的表达水平较Hep3B高。表明三种蛋白在高低转移潜能不同人肝癌细胞中的核心岩藻糖基化程度不同，随肝癌细胞转移潜能的增加而增加。应用免疫荧光发现它们定位在胞浆、Westernblot和实时荧光定量PCR分析蛋白和mRNA表达情况，在MHCC97-L和MHCC97-H中它们蛋白含量及mRNA水平相对较高；应用免疫沉淀结合多种凝集素亲和印迹对AnnexinI和CK8糖链结构改变进行推断，AnnexinI在MHCC97-H中对LCA和刀豆凝集素(ConA)的亲和力较强，在Hep3B中几乎无亲和力，同时蓖麻凝集素(RCA-1)对两种细胞中的AnnexinI都无亲和力；CK8在MHCC97-H中对LCA和RCA-1的亲和力较Hep3B高，而ConA对两种细胞中CK8亲和力则无明显差异。 结论 1.建立了两种相对稳定、标准的高通量糖蛋白质组学共性技术平台：一种是凝集素层析、2-DE联合MALDI-TOF-MS／MS分析；另一种是2-DE和凝集素印迹联合MALDI-TOF-MS／MS分析。 2．应用凝集素层析、2-DE联合MALDI-TOF-MS／MS分析，建立了正常人肝脏组织核心岩藻糖基化蛋白数据库，它共有53种蛋白质构成，主要参与体内代谢过程，发挥催化反应和结合反应的作用。 3．应用2-DE和凝集素印迹技术联合MALDI-TOF-MS／MS分析建立了不同转移潜能人肝癌细胞核心岩藻糖基化蛋白表达图谱。Annexin工，AnnexinII和CK8除异常核心岩藻糖基化外，其蛋白表达水平、RNA水平及糖链结构的其他改变也与肝癌细胞转移潜能相关。 潜在应用价值 1．凝集素层析、2-DE联合MALDI-TOF-MS／MS分析和2-DE、凝集素印迹联合MALDI-TOF-Ms／MS分析分别适用于大样本和小样本的疾病蛋白质组学中蛋白质糖基化修饰谱的研究，对发现与疾病发生、发展中相关的异常糖基化蛋白质有重要价值。 2．正常人肝组织核心岩藻糖基化蛋白质数据库的建立，为机体正常状态下糖蛋白的全面阐述及核心岩藻糖基化功能作用探讨提供了基本的生物学信息。 3．筛检出的异常核心岩藻糖基化的蛋白质，Annexin工，AnnexinII和CK8有可能成为肝癌转移复发的诊断标志物及预后判断指标，以丰富肝癌诊疗指标的选择与组合。 创新点 1．建立了两种相对稳定、标准的高通量糖蛋白质组学共性技术平台，为与疾病发生、发展中相关的糖蛋白质组学研究奠定了良好基础。 2．本研究首次建立正常人肝组织核心岩藻糖基化蛋白质数据库，提出蛋白质的核心岩藻糖基化主要参与体内代谢过程，发挥催化反应和结合反应的作用。 3．运用比较糖蛋白质组学技术手段从Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H中筛出的7种差异核心岩藻糖基化蛋白质中，AnnexinⅠ，AnnexinⅡ和CK8的异常核心岩藻糖基化，蛋白表达水平、RNA水平及糖链结构的其他改变与肝癌细胞转移潜能相关均为首次报道。

目录

引言

第一部分 正常人肝脏核心岩藻糖基化蛋白质数据库的建立及生物信息学分析

第二部分人肝癌细胞系转移相关的核心岩藻糖基化蛋白质组学研究

糖基转移酶与肝癌发生

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