G-CSF对心房、心室心肌细胞增殖的影响及p38 MAPK活性研究

摘要

急性心肌梗死(acutemyocardialinfartion,AMI)是严重危害人类健康的心血管疾病。过量的功能心肌细胞丢失是影响其预后的主要因素。以往认为心肌细胞是终末分化细胞，近年研究发现，正常和病理状态下有增殖分裂的心肌细胞亚群【H】。另外，成体心肌中存在具心脏干细胞特征的亚群体(Lin-c-kit+细胞)，它能够自我更新，克隆复制，多潜能分化，体内参与功能性心肌的新生[5-91。因此，理想的AMI治疗策略应能使心肌和血管再生，重建心功能。 基础研究和初步临床试验证明，AMI后粒系集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF)治疗，能够新生血管和心肌，促进修复过程，逆转心室重构，改善心功能110-1刀。G-CSF为AMI提供了有效的非侵入性的再生治疗新手段。G-CSF治疗心梗的益处，不仅是由于动员骨髓干细胞归巢至梗死区，而且也归因于G-CSF对损伤心肌的直接作用(抗凋亡效应)【16-17】。 Peter等[18]以DsRed标记骨髓干细胞，证实梗死后G-CSF治疗能够增加成心肌细胞系数目，但新生细胞并非骨髓来源而是心肌源性。那么G-CSF是否直接作用于心脏干细胞，促进其向心肌细胞的增殖分化?考虑到G-CSF对心肌细胞直接作用并有促其他细胞增殖的作用，除抗凋亡外，它是否有直接促进心肌细胞分裂效应?由于心脏干细胞主要分布于心房中，心房、心室的心肌细胞增殖状态是否存在着差异?由于p38MAPK信号传导途径在心肌细胞的增殖、凋亡和分化中起重要调控作用，G-CSF对心肌细胞的直接作用是否涉及p38MAPK活性的改变? 本课题首先观察了G-CSF对于不同部位(心房、心室)心肌细胞增殖的影响，同时对照比较心房心室肌细胞增殖有无差异，然后检测p38MAPK活性是否变化，初步探讨G-CSF对心肌细胞的直接作用及与p38MAPK信号通路的关系。 第一部分G-CSF对乳鼠心房、心室心肌细胞增殖的影响 目的：观察心房、心室心肌细胞增殖有无差异及G-CSF是否有促进乳鼠心肌细胞增殖的作用。 方法：SD乳鼠心房、心室原代心肌细胞经10％FBS的DMEM培养液培养24h后，加入干预因素并分别于加入干预因素后24h和72h两个时间点观察细胞增殖指标。培养36h后更换为0．2％FBS的DMEM培养液。实验设2个大组：心房组、心室组。每大组分为2亚组：A．空白对照组。B．G-CSF组。G-CSF终浓度为100ng/ml。每亚组重复3孔。以Brdu掺入测定DNA合成作为细胞增殖指标。 结果：1)心房+G-CSF组、心房对照组Brdu掺入指数均显著高于相应的心室+G-CSF组、心室对照组(P<0．05)。 2)在加入干预因素两个时间点(24h、72h)上，G-CSF组BrdU掺入指数相对于对照组无显著统计学差异(P>O．05)。但是，72h时心房+G-CSF组相对于对照组BrdU掺入率增高，有统计学趋势(P=O．12)。 结论：乳鼠心房肌细胞较心室肌细胞，处于相对活跃的增殖状态。G-CSF对心肌细胞增殖分裂无显著影响，提示G-CSF对心肌细胞的直接作用体现为抗凋亡，而非促细胞增殖。 第二部分G-CSF干预下乳鼠心房、心室心肌细胞的p-38MAPK活性研究 目的：观察血清饥饿状态下心房、心室心肌细胞p38MAPK蛋白活性有无差异及在G-CSF干预下p38MAPK的活性变化。 方法：SD乳鼠心房、心室原代心肌细胞原代心肌细胞经l0％FBS的DMEM培养液静置培养24h后加入干预因素，培养36h后更换为0．2％FBS的DMEM培养液，饥饿2天后westernblot法测定磷酸化p38MAPK蛋白的表达。实验设2个大组：心房组、心室组。每大组分为2亚组：A．空白对照组。B．G-CSF组。G-CSF终浓度为100ng/ml。实验重复3次。 结果：(1)饥饿2天后心房肌细胞p38MAPK活性显著低于心室肌细胞(P<0．05)。 (2)G-CSF干预下，心室肌细胞Phospho-p38MAPK蛋白的表达显著降低(P<0．05)；心房肌细胞Phospho-p38MAPK蛋白的表达有降低的统计学趋势(P=0．08)。 结论：心房肌细胞通过降低p38MAPK的活性而促进增殖。G-CSF干预显著降低心肌细胞p38MAPK活性；抑制P38MAPK，可能介导了G-CSF的抗心肌细胞凋亡。

目录

前言

第一部分G-CSF对乳鼠心房、心室心肌细胞增殖的影响 前言

第一部分G-CSF对乳鼠心房、心室心肌细胞增殖的影响 材料与方法

第一部分G-CSF对乳鼠心房、心室心肌细胞增殖的影响 结果

第一部分G-CSF对乳鼠心房、心室心肌细胞增殖的影响 讨论

第一部分G-CSF对乳鼠心房、心室心肌细胞增殖的影响 第一部分附图

第二部分G-CSF干预下乳鼠心房、心室心肌细胞的P38 MAPK活性研究 前言

第二部分G-CSF干预下乳鼠心房、心室心肌细胞的p38 MAPK活性研究 材料与方法

第二部分G-CSF干预下乳鼠心房、心室心肌细胞的p38 MAPK活性研究 结果

第二部分G-CSF干预下乳鼠心房、心室心肌细胞的p38 MAPK活性研究 讨论

第二部分G-CSF干预下乳鼠心房、心室心肌细胞的p38 MAPK活性研究 第二部分附图

全文小结

参考文献

G-CSF治疗缺血性心脏病中的研究进展

致谢

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