分子佐剂C3d3增强hCGβDNA和粘膜疫苗体液免疫效应的机制

摘要

研究背景 基于hCGβ的避孕疫苗，是目前唯一完成II期临床试验的避孕疫苗。但尚面临许多困难，必须寻找更理想的载体、分子佐剂，合适的免疫途径，以增强它的免疫原性，提高其避孕效果。C3d分子通过与B细胞表面CD21分子的直接结合而发挥生物学作用，因此C3d作为分子佐剂，为解决人群中的个体差异创造机遇，并恰好符合避孕疫苗追求体液免疫效应的目标。本实验室在以往的研究中，将C3d3与hCGβ基因融合，成功构建了hCGβ DNA疫苗pCMV4-hCGβ-C3d3、hCGp粘膜疫苗Lb．hCGβ-C3d3。并且证明分子佐剂C3d3可明显增强避孕疫苗的体液免疫效应及抗生育作用。但这两种疫苗作用的分子机制尚不明了，分子佐剂C3d3的作用机制尚不清楚。 目的 本研究用hCGβDNA疫苗和hCGβ粘膜疫苗分别经小鼠肌肉注射免疫和阴道粘膜接种，观察这两种疫苗在小鼠全身和生殖道局部的抗hCGD体液免疫效应，观察分子佐剂C3d3对免疫反应的作用；分析ASC表面和组织局部的趋化因子/受体和粘附分子配体/受体，探讨ASC游走以及ASC归巢至生殖道的分子机制，以解析hCGβDNA疫苗和粘膜疫苗的抗生育作用。分子佐剂C3d3通过上调B细胞CXCR4和CD62L的表达及促进ASC游走而增强hCGβDNA疫苗体液免疫效应。 方法 将hCG13DNA疫苗pCMV4-hCGβ-C3d3、pCMV4-hCGβ和pCMV4分别肌肉注射BALB/c小鼠。间接ELISA法测定抗hCGβ血清/阴道灌洗液抗体效价；ELISPOT分析小鼠脾脏和子宫的抗体分泌细胞；RT-PCR分析小鼠脾脏B细胞17种趋化因子受体及脾脏组织中相关配体的转录；FCM分析CXCR4蛋白水平；ELISA检测CXCL12的分泌；趋化试验观察CXCL12对外周血B细胞的趋化作用；迁移试验观察CXCL12趋化各免疫组脾脏局部B细胞，再ELISPOT检测趋化f=来的ASC数目；FCM分析脾脏局部B细胞粘附分子CD62L/VLA/LFA的表达；免疫组化分析脾脏相关粘附分子受体MAdCAM/VCAM/ICAM的表达。 结果 在DNA免疫中，pCMV4-hCGβ-C3d3产生抗hCGp IgG血清抗体明显高于pCMV4-hCGβ；抗hCGβ IgA血清抗体两组无明显差异；pCMV4-hCGβ-C3d3产生的阴道灌洗液抗hCGβ IgG/IgA抗体水平较低，与pCMV4-hCGβ比较无明显差异；pCMV4-hCGβ-C3d3脾脏抗hCGβ IgG ASC明显高于pCMV4-hCGβ，脾脏IgAASC与子宫IgG/IgAASC两组间无明显差异。经DNA免疫后，脾脏B细胞CXCR4在pCMV4-hCGβ-C3d3和pCMV4-hCGβ免疫后明显升高，且pCMV4-hCGβ-C3d3明显高于pCMV4-hCGl3；CXCR4的配体CXCL12在粘膜免疫后脾脏组织中亦明显升高，但pCMV4-hCGβ-C3d3与pCMV4-hCGβ无明显差异。因此，C3d3能显著上调脾脏ASC表达CXCR4，但并不能明显提高脾脏局部CXCL12的表达。趋化试验提示，pCMV4-hCGβ和pCMV4-hCGβ-C3d3脾脏组织上清均能明显趋化外周血B细胞，但两组间无明显差异，抗SDF-1抗体可部分阻断趋化作用。迁移试验结果显示，SDF-1能明显趋化pCMV4-hCGβ-C3d3和pCMV4-hCGβ组脾脏局部的B细胞，且pCMV4-hCGβ-C3d3组趋化的B细胞明显比pCMV4-hCGβ组多，加用抗CXCR4抗体后，SDF-1对免疫组脾脏B细胞的趋化作用与对照组无明显差异，用被趋化的B细胞作ELISPOT，pCMV4-hCGβ-C3d3组ASC明显多于pCMV4-hCGβ组，说明C3d3升调节ASC表达CXCR4，增加ASC对CXCL12的反应性，促进ASC游走。FCM分析脾脏B细胞粘附分子发现，在各免疫组LFA和vLA表达较低，且各组间无明显差异，而CD62L在各免疫组均有表达，pCMV4-hCGβ-C3d3和pCMV4-hCGβ组明显高于对照组，且pCMV4-hCGβ-C3d3组显著高于pCMV4-hCGβ组。免疫组化分析脾脏相关粘附分子受体发现，MAdCAM/VCAM/ICAM在各免疫组均有表达，但各组间无明显差异。 结论 hCGβDNA疫苗主要在全身产生体液免疫应答。C3d3能增强系统性体液免疫效应。DNA疫苗促进ASC高表达CXCR4、CD62L，增加对CXCL12的反应性，通过CD62L/MAdCAM的相互作用，有利于ASC游走。分子佐剂C3d3通过上调B细胞CCR9和VLA的表达及促进ASC归巢而增强hCGβ粘膜疫苗体液免疫效应方法将重组乳酸杆菌Lb．pllac、Lb．hCGβ、Lb．hCGβ-C3d3分别经阴道接种BALB/c小鼠。间接ELISA法测定抗hCGβ血清/阴道灌洗液抗体效价；ELISPOT分析小鼠脾脏和子宫的抗体分泌细胞；RT-PCR分析子宫B细胞17种趋化因子受体及子宫组织中相关配体的转录；FCM分析CCR9蛋白水平；ELISA检测CCL25的分泌：趋化试验观察CCL25对外周血B细胞的趋化作用；迁移试验观察CCL25趋化各免疫组子宫局部B细胞，再ELISPOT检测趋化下来的ASC数目：FCM分析子宫局部B细胞粘附分子CD62L/VLA/LFA的表达：免疫组化分析子宫相关粘附分子受体MAdCAM/VCAM/ICAM的表达。结果在粘膜免疫中，Lb．hCGβ-C3d3免疫组血清抗hCGβ IgG抗体水平明显高于Lb．hCGβ组；血清抗hCGβ IgA抗体两组无明显差异；Lb．hCGβ-C3d3免疫组阴道灌洗液抗hCOβ IgG及IgA抗体比Lb．hCGβ明显增高。Lb．hCGβ-C3d3和Lb．hCGβ免疫组脾脏抗hCGβ IgG/IgA ASC无明显差异；Lb．hCGβ-C3d3免疫组子宫抗hCGβ IgG及IgAASC均明显高于Lb．hCGβ组。经粘膜免疫后，子宫局部B细胞CCR9在Lb．hCGβ和Lb．hCGβ．C3d3免疫后明显升高，且Lb．hCGβ-C3d3明显高于Lb．hCGβ；CCR9的配体CCL25在粘膜免疫后子宫组织中明显升高，但Lb．hCGβ-C3d3与Lb．hCGβ无明显差异。说明C3d3能显著上调子宫局部B细胞表达CCR9，但不能明显提高子宫局部CCL25的表达。趋化试验显示：Lb.hCGB和Lb.hCGβ-C3d3免疫组子宫组织上清均能明显趋化外周血B细胞，但是两组间无明显差异，加用TECK抗体可部分阻断趋化作用。迁移试验结果显示，TECK能明显趋化Lb．hCGβ和Lb．hCGβ-C3d3组子宫局部的B细胞，且Lb．hCGβ-C3d3组趋化的B细胞明显比Lb．hCGβ组多，用被趋化的B细胞作ELISPOT，Lb．hCGβ-C3d3组ASC明显多于Lb．hCGβ组。说明C3d3升调节ASC表达CCR9，通过CCR9/CCL25相互作用，增加ASC归巢到生殖道局部。FCM分析子宫B细胞粘附分子发现，在各免疫组CD62L均有表达，但各组间无明显差异；LFA在各免疫组也都有表达，但是表达较低，且各组间无明显差异；VLA在各免疫组均有表达，Lb．hCGβ和Lb．hCGβ-C3d3组明显高于对照组，且Lb．hCGβ-C3d3组B细胞VLA表达较Lb．hCGβ组为高，差异有显著性。免疫组化分析子宫局部相关粘附分子受体发现，MAdCAM在各免疫组均未见明显表达；VCAM只在Lb．hCGβ-C3d3组子宫中有表达；ICAM在各免疫组均有表达，但各组间无明显差异。

目录

论文说明：英文缩略语

声明

前言

第一部分分子佐剂C3d3增强hCGβDNA疫苗的体液免疫效应

材料与方法

结 果

讨 论

第二部分C3d3在DNA免疫中通过增加B细胞表达CXCR4及CD62L促进B细胞再循环

材料与方法

结 果

讨 论

第三部分重组乳酸杆菌Lb.hCGβ-C3d3经小鼠生殖道接种增强抗hCGβ体液免疫效应

材料与方法

结 果

讨 论

第四部分C3d3在hCGβ粘膜免疫中通过促进生殖道B细胞高表达CCR9及VLA增加其归巢

材料与方法

结 果

讨 论

结论

参考文献

致谢

综述1：趋化因子与B细胞归巢

综述2：DNA避孕疫苗的研究现状

博士研究生期间完成的论文和综述