纤溶酶原激活抑制物-1对急性肺损伤小鼠TLR4信号途径的影响

摘要

第一部分PAI-1基因敲除小鼠急性肺损伤模型的特点
　　背景:
　　肺泡及肺血管内纤维蛋白沉积是急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)的特征性病理改变之一。导致纤维蛋白沉积的因素众多,其中局部组织因子介导的凝血酶形成和纤溶酶原激活抑制物-1(PAI-1)表达上调所致的纤溶抑制起重要作用。实验及临床研究发现,ALI/ARDS时肺泡灌洗液(BALF)及血浆PAI-1水平均明显增加。BALF中PAI-1水平升高与疾病不良预后密切相关,但是临床应用抗凝药物并不能改变疾病的进程与预后。提示,PAI-1不仅仅参与了ALI/ARDS的凝血/纤溶过程,可能还有其它更重要的作用。因此,研究PAI-1在ALI/ARDS发病中的作用及机制有重要意义。
　　目的:
　　研究PAI-1基因敲除对脂多糖(LPS)诱导的小鼠ALI模型的影响。
　　方法:
　　通过气管内滴注LPS(5mg/kg)建立ALI模型。根据LPS用药时间,即用药前(Oh)、用药后2h、用药后4h、用药后8h,将PAI-1基因敲除(KO)小鼠与野生型(WT)C57BL/6J小鼠均随机分为四组,称为0h组(WT0h组,KO0h组),2h组(WT2h组,KO2h组),4h组(WT4h组,KO4h组)与8h组(WT8h组,KO8h组)。测定各时间点的肺组织湿/干重比(W/D)、丙二醛含量(MDA)、肺微血管通透性、凝血/纤溶功能及肺组织病理评分。
　　结果:
　　1.KO组小鼠较WT组的小鼠的病死率明显升高(40％vs.10％,P＜0.05)。
　　2.KO8h组小鼠的肺损伤评分为11.1±0.6,较WT8h组小鼠的8.5±0.5明显升高,P＜0.05。
　　3.KO4h组小鼠肺微血管通透性为78.63±7.82、KO8h组小鼠为98.02±10.21,与同一时间点的WT4h组的62.28±8.62及WT8h组小鼠的81.02±11.35相比明显增加,P＜0.05。
　　4.LPS刺激后2h,肺组织湿/干重比即有升高趋势。KO8h组小鼠的W/D为6.36±0.23,显著高于WT8h组的5.48±0.45,P＜0.05。
　　5.同一时间点的KO小鼠与WT小鼠肺MDA结果相似,P＞0.05。
　　6.LPS刺激后,同一时间点的KO组小鼠与WT组小鼠的各项凝血/纤溶指标皆明显异常,但程度相似,P＞0.05。
　　结论:
　　1.LPS诱导的ALI模型中,PAI-1基因敲除小鼠的肺部炎症反应较野生型小鼠严重,存活率下降,凝血/纤溶功能改变程度相似。
　　第二部分PAI-1基因敲除急性肺损伤小鼠TLR4信号途径的变化
　　背景:
　　研究表明PAI-1参与了机体的炎症与免疫反应,但其在肺部的调控作用存在争议。Renekens等研究发现,PAI-1基因敲除的肺炎克雷伯肺炎小鼠较野生型的肺炎克雷伯肺炎小鼠病死率增加,细菌生长负荷增加;但Rijneveld等有关肺炎链球菌肺炎小鼠模型的研究显示,PAI-1基因敲除小鼠病死率与细菌生长负荷与野生型小鼠相比并无变化。这提示PAI-1在革兰阴性或阳性细菌感染过程中,起着不同的作用。其原因可能与两种类型细菌的致病特点不同有关,革兰阴性杆菌主要通过LPS致病,容易发生ALI。
　　由Toll样受体(TLRs)途径启动并级联放大的免疫及炎症反应,是ALI发病的重要病理生理基础。TLR4可特异性识别LPS,LPS的识别和信号转导是宿主对革兰阴性菌发生防御反应的关键。PAI-1在LPS诱导的ALI中扮演什么角色,是否通过影响TLR4途径从而影响疾病的进程,值得进一步探讨。
　　目的:
　　研究PAI-1基因敲除对LPS诱导急性肺损伤小鼠TLR4途径及炎症介质的影响。
　　方法:
　　通过气管内滴注LPS(5mg/kg)建立All模型。根据LPS用药时间,即用药前(0h)、用药后8h,将PAI-1基因敲除(KO)小鼠与野生型(WT)C57BL/6J小鼠均随机分为二组,称为0h组(WI0h组,KO0h组)与8h组(WT8h组,KO8h组)。酶联免疫吸附试验测定各组小鼠BALF、血浆、肺组织炎症介质(IL-6、IL-10及IFN-γ)水平,实时荧光定量PCR测定肺组织IL-6、TLR4、SOCS1与IRAK-M的mRNA表达水平,免疫组织化学法测定肺组织IRAK-M蛋白表达水平,western-blot法测定IRAK-M、SOCS1及JNK磷酸化、ERK磷酸化蛋白表达水平。
　　结果:
　　1.与0h组小鼠相比,KO8h组与WT8h组小鼠BAILF中IL-6、IL-10及IFN-γ蛋白水平均明显增加,P＜0.05。并且,KO8h组小鼠BALF中IL-6、IL-10及IFN-γ水平要明显高于WT8h组,P＜0.05;在肺组织,KO及WT两种小鼠的IL-6、IL-10及IFN-γ水平也有上述类似变化;与WT8h组小鼠相比,KO8h组小鼠血浆IL-6、IFN-γ水平均明显增加,P＜0.05;与0h组小鼠相比,KO8h组与WT8h组小鼠血浆IL-10水平变化不明显。
　　2.与oh组小鼠相比,KO8h组与WT8h组小鼠肺组织IL-6mRNA水平分别增加3.2倍和1.84倍。与WT8h组小鼠相比,KO8h组小鼠IL-6mRNA水平为2.4倍。
　　3.与0h组小鼠相比,WT8h组小鼠肺组织IRAK-MmRNA、SOCS1mRNA水平明显增加,而KO8h组小鼠肺组织这两种基因改变未达到统计学意义;与0h组小鼠相比,KO8h组及WT8h组小鼠肺组织TLR4mRNA水平均显著增加(分别增加4.2倍及27.2倍);KO8h组小鼠TLR4mRNA水平较WT8h组有明显的增加(6.5倍),P＜0.05。
　　4.免疫组化显示WT8h组小鼠IRAK-M阳性表达明显强于KO8h组小鼠(IOD3290±358.9vs.1113.4±229.2),P＜0.05。
　　5.Westernblot检测结果示KOOh组及WT0h组小鼠肺组织IRAK-M蛋白弱表达,KO8h组及WT8h组小鼠肺组织IRAK-M表达增加,以WT8h组小鼠增加更明显(P＜0.05);0h组小鼠SOCS1蛋白均有表达,KO8h组及WT8h组小鼠SOCS1表达均有增加,但只有WT8h组小鼠SOCS1增加与WT0h组小鼠相比差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　6.Westernblot检测结果示KO0h组及WTOh组小鼠没有或轻微p-JNK、p-ERK表达,KO8h组及WT8h组小鼠有明显的表达;与WT8h组小鼠相比,KO8h组小鼠p-JNK、p-ERK蛋白表达增加明显,P＜0.05。
　　结论:
　　1.PAI-1基因敲除的ALI小鼠与野生型ALI小鼠相比,TLR4表达增加,而TLR4负性调节因子如IRAK-M、SOCS1表达受抑制;同时伴BALF、血浆及肺组织炎症因子表达增加(以IL-6、IFN-γ更明显),JNK、ERK磷酸化更明显:
　　第三部分肝素及尿激酶对PAI-1基因敲除急性肺损伤小鼠TLR4和凝血功能的影响
　　背景:
　　研究发现,ALI/ARDS患者BALF的PAI-1水平增加,提示ARDS时肺脏处于一种促凝环境。BALF中PAI-1水平升高与ALI/ARDS的不良预后密切相关,说明PAI-1的变化是影响ALI/ARDS的重要因素。同时这也提示,抗凝治疗可能会改善ALI/ARDS的预后。
　　肝素和尿激酶是临床上广泛应用的抗凝药,用于防治血栓栓塞性疾病、DIC的早期治疗及体外抗凝等。目前肝素及尿激酶应用于肺损伤的实验研究数目有限,结论不一,但总体结果不佳。同时也缺乏对其作用机制的深入研究。本试验前二个部分结果显示,PAI-1敲除的ALI小鼠较野生型ALI小鼠凝血/纤溶功能改变不明显,但病死率增加,TLR4信号途径增强,炎症介质释放增加。抗凝药物是否象PAI-1一样影响TLR4信号途径,值得研究。
　　目的:
　　研究肝素及尿激酶对All小鼠TLR4信号途径及凝血功能的影响;探讨肝素及尿激酶的治疗作用与PAI-1基因的关系;
　　方法:
　　将PAI-1基因敲除(KO)小鼠与野生型C56BL/6J小鼠(WT)均随机分为对照组(WT对照组,KO对照组)、肝素治疗组(WT肝素治疗组,KO肝素治疗组)与尿激酶治疗组(WT尿激酶治疗组,KO尿激酶治疗组)。对照组通过气管内滴注LPS5mg/kg:肝素治疗组小鼠在LPS刺激同时尾静脉注射肝素400IU/kg;尿激酶治疗组小鼠在LPS刺激同时尾静脉注射尿激酶5万u/kg。酶联免疫吸附试验测定各组小鼠血浆、肺组织炎症介质(IL-6、IL-10及IFN-γ)水平,实时荧光定量PCR测定肺组织IL-6、TLR4、SOCS1与IRAK-M的mRNA表达水平,western-blot法测定IRAK-M、SOCS1蛋白表达水平。
　　结果:
　　1.WT对照组病死率为10％,生存时间22±1.3h;KO对照组病死率为40％,生存时间16.2±2.1h:WT肝素治疗组病死率为15％与WT对照组相比、KO肝素治疗组病死率为35％与KO对照组相比,P＞0.05;WT尿激酶治疗组病死率为20％、KO尿激酶治疗组病死率为45％,与WT对照组、KO对照组相比差异无统计学意义。
　　2.WT对照组ALI评分为8.5±0.5,肺微血管通透性81.02±11.35,W/D值5.48±0.51;KO对照组ALI评分为11.1±0.6,肺微血管通透性98.02±10.21,W/D值6.36±0.23;与WT对照组、KO对照组相比,WT肝素治疗组及KO肝素治疗组ALI评分减小(6.4±0.4,7.3±0.5,P＜0.05),肺微血管通透性下降(60.32±14.3,72.56±10.12,P＜0.05),W/D值降低(4.32±0.60,5.0±0.50,P＜0.05);与WT对照组、KO对照组相比,尿激酶治疗组的ALI评分,肺微血管通透性及W/D值也明显减小,P＜0.05。
　　3.与WT对照组、KO对照组小鼠相比,肝素治疗组、尿激酶治疗组小鼠的凝血/纤溶异常改善。但肝素或尿激酶治疗后的KO小鼠与WT小鼠之间,各项指标差异无统计学意义。
　　4.ELISA结果显示,与WT对照组、KO对照组小鼠相比,肝素治疗组及尿激酶治疗组小鼠血浆与肺组织IL-6释放减少,两种基因型小鼠IL-6下降幅度基本一致;与WT对照组、KO对照组组小鼠相比,肝素治疗组及尿激酶治疗组小鼠血浆与肺IL-10、IFN-γ变化不明显。
　　5.肝素治疗组及尿激酶治疗组小鼠肺组织IL-6mRNA水平较WT对照组、KO对照组小鼠明显下降(P＜0.05),且两种基因型小鼠下降幅度基本一致。
　　6.real-timePCR及western-blot结果均提示,与WT对照组、KO对照组相比,肝素治疗组及尿激酶治疗组小鼠TLR4及TLR4负性调节因子IRAK-M、SOCS1变化不明显。
　　结论:
　　1.肝素、尿激酶治疗改善了ALI小鼠的凝血/纤溶指标,但两种基因型小鼠之间无明显差异;肝素、尿激酶治疗虽然减小了ALI评分、肺微血管通透性及W/D比值,但并不影响ALI的病死率。ALI的抗炎作用仅仅表现在降低了血浆及肺组织IL-6的释放,但对ALI小鼠的TLR4及TLR4负性调节IRAK-M、SOCS1无影响。
　　2.肝素、尿激酶对ALI的治疗作用在WT及KO小鼠之间无明显差异。