三种病毒载体对人脐带华通胶间充质干细胞转染效果及基因表达的对比研究

摘要

研究背景
　　 基因治疗(Gene therapy)的出现为心血管疾病提供了一种潜在的重要治疗手段，然而，心血管疾病基因治疗的进展一直不大，一个关键制约因素是缺乏高效的基因转运系统将基因治疗局限于特定靶点，并能优化转基因表达和治疗疗效。研究发现人脐带华通胶来源的问充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)-人脐带华通胶间充质干细胞(Human umbilical cord Wharton’s jelly-derived MSCs，hUCMSCs)具有更多优势，有望成为临床治疗中的理想种子细胞。携带靶基因的hUCMSCs通过干细胞表面的干细胞因子感知病变区域信号，自动向靶位迁移，在病变区域自我分化、自我更新，整合入干细胞的目的基因得以长期稳定表达，这样既补充了经遗传基因修饰过的理想的“种子”细胞，也使靶基因有效调控病变组织的分子异常表达，将同时解决丢失的细胞、基因的运输、基因的靶向、基因的长期表达等分子生物治疗学的关键。这将是心血管疾病治疗的突破性进展。
　　 基因转染必须借助载体将外源基因导入生物细胞，其最大障碍在于载体的安全性和有效性，对载体的研究以提高基因治疗技术亦是必要的。
　　 研究目的
　　 1.分离培养并鉴定人脐带华通胶间充质干细胞，为后续基因转染准备试验细胞；
　　 2.对比研究腺病毒(Adenoviruse，Ad)、重组腺相关病毒(Recombinant Adeno-Associated Virus，rAAV)、慢病毒(Lentiviruse，LV)载体介导增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescentprotein，EGFP)基因对人脐带华通胶间充质干细胞转染效果及基因表达情况。
　　 研究方法
　　 1.取剖腹产无菌新鲜脐带，采集华通胶组织，用组织块贴壁法，接种于胎牛血清+DMEM/F12培养基中培养细胞，细胞融合80％以上后传代培养。同时检测细胞增殖能力、细胞免疫表型(CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC、HLA-DR)，并行成骨成脂细胞诱导分化等检测；
　　 2.应用介导EGFP基因的腺病毒(Ad5F35-mCMV-EGFP)、腺相关病毒(rAAV2-EGFP)、慢病毒(LN-EGFP)载体感染P3代人脐带华通胶间充质干细胞，在1、3、7、14、21天应用荧光显微镜观察细胞EGFP表达情况，于7、14、21天收集感染细胞，应用荧光定量PCR、Western Blotting方法检测EGFP基因及蛋白表达。
　　 研究结果
　　 1.人脐带华通胶剪碎后，于胎牛血清+DMEM/F12培养基培养1～2周左右，显微镜下可见组织块间隙可见散在分布的长梭形细胞贴壁生长，3周左右可见细胞集落融合，融合达80％以上时传代培养以1×10％cells/75cm2培养瓶中培养，3～5d细胞即融合可传代，传代观察每代细胞形态与原代基本一致，增殖能力未见下降，最远传代至20代；取P2代hUCMSC应用流式细胞仪检测细胞免疫表型显示：基质细胞抗原CD44/CD73/CD90/CD105/HLA-ABC高表达，不表达造血干细胞抗原CD34/CD45及白细胞相关抗原HLA-DR；成骨成脂细胞诱导分化后酋素红、碱性磷酸酶、油红染色呈强阳性。
　　 2.1)对hUCMSCs基因转染中，腺病毒、腺相关病毒、慢病毒载体组最佳感染复数不同，分别为1×104、1×105、10,在最佳感染复数时，腺病毒较腺相关病毒、慢病毒载体转染效率高，差别有统计学意义(p<0.05)；
　　 2)最佳感染复数时，腺病毒组较腺相关病毒、慢病毒组的EGFP基因及蛋白表达量较高，差别有统计学意义(p<0.05)；
　　 3)腺病毒、腺相关病毒、慢病毒三种病毒载体转染hUCMSCs后EGFP基因及蛋白表达呈现不同规律，腺病毒载体组转染6h即见荧光表达，而腺相关病毒、慢病毒组均于转染后3～5d方可见荧光表达，腺病毒组EGFP基因不能持续稳定表达，腺相关病毒、慢病毒组EGFP基因持续稳定表达，最远观察至转染5周；
　　 4)腺相关病毒载体(rAAV2-EGFP)介导EGFP基因成功转染hUCMSCs，提示不同腺相关病毒载体分型的转染特性不同。
　　 研究结论
　　 1.应用组织块贴壁培养法可成功从人脐带华通胶组织中提取脐带间充质干细胞，经细胞免疫表型及诱导分化验证符合国际细胞治疗协会(International society for cellular therapy，ISCT)规定的MSCs鉴定的最低标准；
　　 2.腺病毒、腺相关病毒、慢病毒载体介导EGFP基因均成功转染hUCMSCs，筛选出慢病毒载体为较优基因转染载体，同时也对腺相关病毒载体有了新的认识。
　　 3.介导EGFP基因的慢病毒载体成功转染hUCMSCs，转染最佳MOI值的确定及转染条件的探索，为实验室下一步构建含慢病毒载体质粒(PNL-S100A1-IRES2-EGFP)的基因工程细胞提供了实验基础。