原生质体融合提高植物内生放线菌抗菌活性

摘要

植物内生放线菌作为新的微生物资源具有广泛的应用前景，无论在控制植物病害的生物防治领域，还是从中寻找新型杀菌剂或药物先导化合物方面都极具开发价值。为了提高植物内生放线菌的抗菌活性，将本研究室分离保存的2株植物内生放线菌SF4、SG2和1株具有较好抗菌活性的生防放线菌SC1作为亲本，开展双亲和三亲本的原生质体融合，通过研究，获得了综合亲本优良性状的新型高效菌株。 通过蔗糖质量浓度、Gly质量浓度、亲本菌株对数生长期、酶的种类与浓度、酶解时间与温度以及亲本菌株灭活条件的确定，以原生质体形成率和再生率为指标，确定及优化了亲本菌株的融合条件。 实验得出，亲本菌株SF4和SG2的融合条件为：蔗糖质量浓度：SF4为30％，SG2为20％；Gly质量浓度：SF4和SG2均为0.5％；对数生长期：SF4为48～81h，SG2为33～72h；酶的种类：溶菌酶；酶的浓度：SF4为15 mg·mL-1，SG2为10 mg·mL-1；酶解温度：均为35℃；酶解时间：SF4为90min，SG2为60min；热灭活温度：均为55℃；热灭活时间：SF4为15min，SG2为10min；紫外线灭活时间：SF4为4min，SG2为2min。 根据以上优化条件，以2个亲本或3个亲本菌株进行原生质体融合，获得了25株融合子。通过遗传稳定性、菌落形态特征以及皿内抑菌活性测定进行融合子筛选，共获得6株整体性能稳定且有较好抑菌活性的融合菌株。 通过抗菌机理、形态与培养特征、产孢量和菌丝生长量、生理生化特征、内生性以及多胺测定对融合菌株进行进一步的检测，发现融合菌株与亲本菌株既有差别，又有相同之处，说明亲本原生质体融合后形成的融合菌株既保留了亲本的某些性状，而其自身又产生了一些新的性状。 最后通过分子生物学方法对亲本菌株及其融合菌株进行检测，利用细菌通用引物对融合菌株及其亲本16S rDNA进行扩增，均获得大小约1.5kb的片段，用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，以亲本菌株为对照，酶切图谱中既具备与亲本相同的一些条带，也有完全不同于亲本的新条带，这可能与融合菌株产生的一些新性状相对应。 总之，本研究利用原生质体融合技术，实现了植物内生放线菌之间以及植物内生放线菌与土壤放线菌之间的融合，为开发和利用植物内生放线菌资源提供了新思路，同时也为拓宽原生质体融合技术的应用范围提供了新的证明。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1植物内生放线菌在生物防治中的应用

1.1.1植物内生菌作为生防菌的特点

1.1.2内生放线菌在植物病害生物防治中的应用

1.1.3内生放线菌在植物病害生物防治中存在的问题

1.2微生物细胞融合技术

1.2.1微生物细胞融合技术在育种上的应用

1.2.2原生质体的制备与再生

1.2.3原生质体融合与融合子的鉴定方法

1.2.4分离子与杂种性质测定

1.3原生质体融合的应用

1.3.1病毒传递

1.3.2核的转移

1.3.3质粒转移

1.3.4耐热性研究及菌株筛选

1.3.5改良菌种

1.3.6应用于抗生素的研究

1.3.7用于酶的研究

1.4论文设计思路

第二章材料与方法

2.1试验材料

2.1.1供试菌株

2.1.2培养基

2.1.3主要试剂、溶液与仪器

2.2试验方法

2.2.1原生质体融合条件的优化

2.2.2原生质体融合

2.2.3融合子的筛选

2.2.4融合子的检测

第三章结果与分析

3.1原生质体融合条件的优化

3.1.1蔗糖质量浓度

3.1.2 Gly质量浓度

3.1.3出发菌株的生长曲线及对数生长期的确定

3.1.4细胞壁降解酶

3.2融合子的获得与筛选

3.2.1菌落形态特征

3.2.2 皿内抑菌活性测定

3.3融合子的检测

3.3.1融合子抗菌机理

3.3.2形态与培养特征

3.3.3产孢量和菌丝生长量

3.3.4生理生化特征

3.3.5内生性测定

3.3.6多胺测定

3.3.7分子生物学检测

第四章结论与讨论

4.1结论

4.2讨论

4.2.1植物内生菌

4.2.2内生性的检测

4.2.3原生质体再生

4.2.4融合子检测

附图

参考文献

致谢

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