音猬因子方案定向诱导人骨髓基质干细胞分化为神经细胞的研究

摘要

随着工业文明的快速发展，外伤性脊髓损伤患者的数量日渐增多，但脊髓损伤的治疗却一直是现代医学的难题，世界各地的医务工作者都在积极探索有效的治疗方法。近年来随着组织工程研究的兴起，使用干细胞组织工程技术治疗脊髓损伤受到了极大关注，为修复脊髓损伤提供了新的途径。其中种子细胞的选择与获取是神经组织工程研究的基础和热点。目前研究较多的种子细胞有神经干细胞、胚胎干细胞、骨髓基质干细胞、雪旺细胞及嗅鞘细胞等。干细胞由于具有高度的自我更新与多向分化潜能，成为组织工程研究中重要的靶器官。骨髓基质干细胞是骨髓中的非生血干细胞，其起源于中胚层未分化的间充质细胞。由于具有取材便利，来源丰富，易于扩增分离，具有向多种中胚层和神经外胚层细胞分化的能力，且分化后回输自体时不存在免疫排斥及伦理学束缚等特点，成为最具潜力的种子细胞。 本实验应用密度梯度离心法分离培养骨髓基质干细胞，研究其生物学特性，采用全反式维甲酸、音猬因子和碱性成纤维生长因子8 的不同组合方案诱导骨髓基质干细胞定向分化为神经细胞，并进一步研究不同组合对细胞数量和活性的影响，寻找骨髓基质干细胞定向分化为神经细胞的最佳方案，为神经组织工程提供充足、稳定的细胞来源。 实验第一部分应用密度梯度离心法分离骨髓基质干细胞，培养并传代观察。研究并记录其生长特性和生物学特点；根据传代（P5）后细胞的形态学特征和成骨特性对分离、培养、传代后的骨髓基质干细胞综合鉴定。 结果证实： 1．实验应用密度梯度离心法分离人骨髓基质干细胞，方法简便，成本低廉，原代培养成功率高达100％，所获取细胞48h 贴壁率高、生长稳定、增殖速度快、形态较为均一。证实本实验方法可以稳定获取和扩增人骨髓基质干细胞。 2．根据细胞的形态学特征、表面特异性抗原和成骨特性对传代（P5）后细胞进行综合鉴定，发现所获取细胞外部形态上都成纺锤形或星形成纤维细胞状，形态较为均一；具有公认的骨髓基质干细胞相对特异性抗原；可以稳定诱导分化为骨细胞，证实所获取细胞为具有多向分化潜能的骨髓基质干细胞。 实验第二部分为采用全反式维甲酸、音猬因子和碱性成纤维生长因子8的不同组合方案诱导骨髓基质干细胞定向分化为神经细胞，并进一步研究不同组合对细胞数量和活性的影响，寻找骨髓基质干细胞定向分化为神经细胞的最佳方案。 结果证实： 1．体外使用音猬因子（sonic hedgehog,SHH）可以诱导人骨髓基质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞（神经干细胞、神经细胞、神经胶质细胞），且在一定浓度范围内呈剂量依赖效应。C 组组合（SHH 500ng/ml,FGF-8 100ng/ml）为最佳诱导浓度，以较低浓度的诱导剂诱导产生的神经样细胞最多。且音猬因子可以促进细胞增殖，提高细胞成活率。 2．使用SHH 联合RA 共同模拟胚胎发育过程中的体内环境来诱导BMSCs定向分化为神经元细胞，这种组合方法可以进一步提高诱导效率，并降低RA对细胞的毒性，提高细胞成活率。 本实验成功、稳定的获取了人骨髓基质干细胞，并对其生物学特征进行了初步分析、鉴定。应用音猬因子及音猬因子与RA 组合高效诱导人骨髓基质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞（神经干细胞、神经细胞、神经胶质细胞）为进一步研究骨髓基质干细胞分化成神经样细胞的分子机制，获得足量高活性的神经组织工程种子细胞提供了新的思路与方案。