脂肪酸用于螺旋藻、节旋藻分类的可行性研究

摘要

螺旋藻、节旋藻系蓝藻门（Cyanophyta），段殖藻目（Hormogonales），颤藻科（Oscilatoraceae），是光合自养型原核微生物。人们借助于16S rRNA、16S-23S rRNA（ITS区）、cpcB、cpcA、hoxY、psbA、cpcE-F等基因序列分析，发现螺旋藻、节旋藻在属水平上具有明显差别，认为螺旋藻、节旋藻应为独立的两个属。但关于种定义的问题仍在争论。本实验室在获得大量新藻株的基础上，欲采用多相分类方法，构建相对完善的螺旋藻、节旋藻种属分类系统。课题组成员首先基于16S rRNA基因、ITS区、rpoC1基因、cpcB基因、psbA基因、hoxY基因序列分别构建系统发育树，均支持螺旋藻、节旋藻独立为两个不同属的观点。但是，个别藻株的归属不稳定，且属内藻株的基因序列相似性较高，无法确定不同种。因此为了验证基于基因序列分类的准确性，进一步寻找种水平分类的靶标分子，本课题以渤海海滨湿的螺旋藻、节旋藻藻株为研究对象，检测其脂肪酸组成及含量，通过聚类分析寻找特征脂肪酸，并以脂肪酸为标记进行系统发育分析，丰富螺旋藻、节旋藻的分类依据和方法，以期获得更能反映藻株亲缘关系的分类结果。
　　本研究主要内容包括：⑴藻株的分离纯化：从在渤海海滨湿地及其周边水域采集的水样中，分离纯化获得34株单藻丝纯种，扩大了本研究的样本量，并对其进行形态特征进行了研究；⑵脂肪酸检测方法的建立：首先对比了VF-23MS与HP-88两种色谱柱对37种脂肪酸甲酯的分离效果，选取了能将37种脂肪酸甲酯有效分离的HP-88色谱柱，并确立了最优色谱条件，即进样口：加热器250℃，分流比8:1；控制模式为流速控制，流速为0.5mL/min，柱前压19.783psi；升温程序：初始温度100℃，保持4min，以8℃/min上升至175℃，保持7min，然后以1℃/min上升至186℃，保持3min，最后以5℃/min升至230℃，保持30min；检测器温度（FID）260℃。其次，在脂质萃取过程中，考察了不同溶剂的萃取效果，依据脂质提取率和色谱图质量，最终确定正己烷为提取藻株脂肪酸的萃取溶剂。再次，Central Composite响应面优化螺旋藻脂肪酸提取条件，建立回归模型，获得优化方案，即超声时间21min，水浴时间93min，催化剂浓度1.8％，甲酯化温度70℃，在此优化条件下进行6次平行试验，得到平均峰面积为31008.1667，与理论值相比，其平均偏差为5.59%。最后，对整个实验方法进行加标回收率实验，在最优实验条件下回收率为94.56%~103.23%，表明该方法回收率比较稳定，为后续的脂肪酸检测提供了依据；⑶螺旋藻、节旋藻藻株分类：应用本研究建立的检测方法对84株供试藻株进行脂肪酸提取、气相色谱分析，最后通过聚类分析，寻找可用于螺旋藻（节旋藻）属种类的脂肪酸生物标记。研究表明：F-351、F-1070两藻株不含C18:3n6，结合基于16S rRNA基因、ITS区等分子方法的聚类结果，进一步支持节旋藻、螺旋藻两属之间的差异性脂肪酸成分为γ-亚麻酸的观点；节旋藻属脂肪酸组分除含有γ-亚麻酸（C18:3n6）这一特征组分外，均有高含量的C16:0；另外，大部分藻株也含有C16:1、C18:0、C18:1n9c、C18:2n6c；以10个脂肪酸统计参数为指标对节旋藻属藻株进行聚类分析，将81个供试藻株划分为5个脂肪群；并通过聚类分群分析发现，以脂肪酸为标记的分类结果与基于 psbA基因序列的聚类结果存在一定的一致性；依据脂肪酸分析，修正藻株TJBC3的分类地位，该藻株应归为螺旋藻属；针对基于psbA基因序列及联合基因分析提出的藻株F904独立于螺旋藻属、节旋藻属，与原先对该藻株为Spirulina platensis的鉴定结论之间冲突，本实验结果认为该藻株仍属于节旋藻属。

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第一章 前 言

1.1 课题的研究背景

1.2 课题的研究依据及意义

第二章 螺旋藻、节旋藻分离纯化

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果与分析

2.5 本章小结

第三章 螺旋藻气相检测

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果与分析

3.5 本章小结

第四章 螺旋藻、节旋藻脂肪酸分类学特性

4.1 引言

4.2 实验材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第五章 总结与展望

5.1 研究结论

5.2 研究创新点

5.3 研究不足以及今后进一步工作的建议

参考文献

发表论文、参加科研情况说明

（一）发表论文

（二）参加科研项目

致谢