多环芳烃和渔用抗生素在凡纳滨对虾体内蓄积毒性效应的研究

摘要

本文根据目前我国近海多环芳烃污染现状以及渔用抗生素的使用情况,以我国养殖的甲壳类主要品种凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,以毒性最强的多环芳烃(PAHs)—苯并(a)芘(BaP)作为多环芳烃的代表,以养殖过程中常用的抗生素—氟苯尼考(FLR)作为渔用抗生素的代表,研究了PAHs(BaP)在凡纳滨对虾鳃和肝胰腺中的含量分布,测定了这两种组织中PAHs的解毒代谢酶和相关核受体调节基因的表达,大分子损伤,并且初步研究了BaP对凡纳滨对虾免疫和抗氧化系统的影响;研究了渔用抗生素(FLR)在凡纳滨对虾鳃、肝胰腺和肌肉中的组织分布及消除情况,测定了肝胰腺中FLR的代谢酶和相关基因的表达,氧化损伤效应,并且初步研究了FLR对凡纳滨对虾鳃丝和肝胰腺免疫和抗氧化系统的影响;得到了如下的结果:
　　1.多环芳烃(BaP)在凡纳滨对虾体内蓄积毒性效应的研究
　　本研究采用实验室试验方法,将凡纳滨对虾暴露于.03μg/L,.3μg/L,μg/L BaP21 d,分别于0,d,d,d,d,d,d取样,测定了BaP在凡纳滨对虾鳃丝和肝胰腺中的累积量,并比较分析了BaP对凡纳滨对虾两种器官累积的时间剂量效应。.03μg/L BaP处理组鳃和肝胰腺中BaP的累积量在3 d时已显著高于对照组,d-d BaP的累积量趋于稳定。.3和μg/L BaP处理组鳃丝中BaP的累积量在1 d时已显著高于对照组,并且在3 d-d内随时间而逐渐增高,d时累积量显著高于第3 d的累积量,d-d BaP的累积量趋于稳定。两种器官对于BaP的累积量都随着海水中BaP浓度的增高而显著升高。并且肝胰腺中BaP的累积大于鳃。BaP可以较快的从水环境中吸收
　　为了研究多环芳烃在凡纳滨对虾体内的解毒代谢过程,测定了以下几种解毒代谢酶及相关基因(i)I相解毒代谢酶(AHH,EROD,EH)和II相解毒代谢酶(GST,SULT,UGT);(ii)解毒代谢相关基因(AhR,CYP1A1,GST,SULT)。BaP胁迫(.03,.3,3μg/L)后-,-,-,-,-,d取样。除.03μg/L处理组所有的解毒酶活性以剂量依赖的方式增加。利用实时RT-PCR测定基因的转录情况,结果表明,在染毒的d内,AhR,CYP1A1,GST,SULT mRNA的表达具有明显的时间-剂量效应,这表明这些基因可能是BaP的潜在目标破坏解毒系统系统。从所有的基因mRNA表达的一致性来看,甲壳动物中可能存在类似于脊椎动物AhR介导的PAHs解毒代谢途径。此外,肝胰腺酶活性要高于鳃。这些结果不仅可以为BaP在甲壳动物体内的解毒代谢提供信息,而且可以为养殖环境的监测提供科学数据。
　　采用实验室试验将凡纳滨对虾暴露于0.03,.3,μg/L BaP21 d,分别于0,1 d,d,d,d,d,d取样,研究了BaP对凡纳滨对虾鳃和肝胰腺的大分子损伤效应(DNA损伤,脂质过氧化,蛋白羰基化)。结果表明两种组织中DNA损伤程度与染毒浓度呈负相关,MDA含量和PC含量与染毒浓度呈正相关。F值d时高浓度处理组表现出极显著下降,然后逐渐趋于稳定。.3,3μg/L BaP处理组鳃中MDA含量和PC含量d时显著上升(P<.05),d时略降,实验结束时仍显著高于对照组。肝胰腺中MDA含量和PC含量最高值出现在第d。
　　采用实验室试验将凡纳滨对虾暴露于0.03μg/L,.3μg/L,μg/L BaP21 d,分别于0,d,d,d,d,d,d取样,研究了BaP对凡纳滨对虾免疫指标(THC, pro-PO, PO,α-M,吞噬活力,抗菌和溶菌活力)和抗氧化指标(T-AOC, SOD, GSH, GSH/GSSG)的影响,结果表明BaP对各个免疫指标和抗氧化指标除SOD外有抑制作用,其中THC,酚氧化酶活力,吞噬活力,溶菌活力和GSH含量在BaP胁迫下具有明显的时间剂量效应,可以作为评估养殖环境BaP污染的敏感指标。
　　2.渔用抗生素(氟苯尼考)凡纳滨对虾体内蓄积毒性效应的研究
　　采用实验室实验连续投喂凡纳滨对虾mg kg? and200 mg kg?体质量氟苯尼考d,于投喂渔药的第d,d以及停止投喂抗生素的第d,d,d,10 d取样,氟苯尼考在凡纳滨对虾不同组织累积和消除表明:凡纳滨对虾连续d口服氟苯尼考后,药物浓度在各个组织逐渐升高,于d时达到最高值,药物在各组织中的分布为肝胰腺>鳃>肌肉,药物在肝胰腺中残留最多。在停止投喂渔药(-16 d)阶段,药物浓度在各个组织迅速下降。
　　为了研究渔药抗生素在凡纳滨对虾体内的代谢过程,测定了以下几种代谢酶及相关基因(i)I相解毒代谢酶(EROD)和II相解毒代谢酶(GST);(ii)解毒代谢相关基因(CYP1A1, CYP3, CYP4, GST)。结果表明,对凡纳滨对虾肝胰腺EROD活力、CYP1A1、CYP3、CYP4 mRNA表达、GST活力和GST mRNA表达影响显著(P<0.05),而对照组无明显变化。在投喂渔药期间(-6 d),各处理组EROD活力、CYP1A1、CYP3 mRNA表达、GST活力和GST mRNA表达均被显著诱导,于d时达到最大值,CYP4 mRNA表达呈逐渐下降趋势,d时达到最小值。在停止投喂渔药(-16 d)阶段,各处理组肝胰腺EROD活力、CYP1A1、CYP3 mRNA表达、GST活力和GST mRNA表达逐渐下降,CYP4 mRNA表达则逐渐升高,于停止投药d时恢复至对照组水平。
　　FLR对凡纳滨对虾健康生理影响的结果表明:在投喂渔药期间(-6d),各处理组总血细胞数量、血细胞酚氧化酶原活力、血浆酚氧化酶活力、血浆α巨球蛋白、血细胞吞噬活力、血浆溶菌活力和血浆抗菌活力d内呈峰值变化,均于d达到最小值和最大值(P<0.05)。在停止投喂渔药(-16 d)阶段,各免疫指标恢复至对照组水平。氟苯尼考和诺氟沙星对凡纳滨对虾血淋巴总抗氧化能力(T-AOC)、SOD活力、GSH/GSSG产生显著影响(P<0.05),而对照组无明显变化。在投喂渔药期间(-6d),各处理组T-AOC、GSH/GSSG呈逐渐下降趋势,于d时达到最小值,SOD活力被显著诱导,d时达到峰值。在停止投喂渔药(-16 d)阶段,各处理组T-AOC、SOD活力和GSH/GSSG于停止投药d时恢复至对照组水平。
　　FLR对凡纳滨对虾大分子损伤效应的结果表明:在投喂药饵期间,F值d时各处理组表现出显著下降,停止投喂药饵后,低浓度组逐渐恢复正常,而高浓度F值处于较低的水平,与对照组差异显著。在投喂药饵期间,肝胰腺中MDA含量显著上升(P<.05),于d时达到最高值。肝胰腺中羰基化蛋白含量在投喂药饵d内逐渐升高,停止投喂药饵后直至实验结束又逐渐下降。

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前言

第一章 综述

1多环芳烃对海洋生物毒理学研究进展

2. 渔药在水产动物体内蓄积毒性研究进展

3 论文的立体依据、研究内容及意义

第二章 多环芳烃在凡纳滨对虾体内蓄积毒性效应的研究

第一节 多环芳烃（苯并[a]芘）对凡纳滨对虾蓄积毒性效应的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二节 凡纳滨对虾在多环芳烃（苯并[a]芘）胁迫下解毒代

1材料与方法

2. 实验结果

3 讨论

第三节 多环芳烃（苯并[a]芘）对凡纳滨对虾组织损伤效应

1 材料方法

2 实验结果

3.讨论

第四节 多环芳烃（苯并[a]芘）对凡纳滨对虾生理健康指标

1 材料与方法

2 实验结果

3.讨论

4. 结论

第三章 渔用抗生素在凡纳滨对虾体内蓄积毒性效应的研究

第一节 渔用抗生素（氟苯尼考）在凡纳滨对虾体内蓄积毒

1 材料与方法

2. 实验结果

3 讨论

第二节 渔用抗生素（氟苯尼考）在凡纳滨对虾体内代谢途

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第三节 渔用抗生素（氟苯尼考）对凡纳滨对虾组织损伤效

1. 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

第四节 渔用抗生素（氟苯尼考）对凡纳滨对虾生理健康指

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

致谢

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