苹果果实中苹果酸代谢关键酶基因的克隆和表达分析

摘要

苹果(Malus domestica B．)是世界上最重要的鲜食和加工果品之一。目前，我国已成为世界上最大的鲜食苹果和苹果浓缩汁生产国，但加工原料多是含酸量较低的鲜食苹果，浓缩汁产品酸度不高，使其在国际市场上价格竞争力较低。生产上迫切需要发展酸度高的加工品种。为了研究苹果酸度的调控机制，本文克隆了苹果酸代谢和储藏过程中4个关键酶基因的全长或部分eDNA，并对其进行了表达分析。主要结果如下： 1．从苹果果实中克隆了细胞质NADP-ME基因M-ME(GenBank注册号： DQ280492)、液泡膜H<'+>-ATPase A亚基基因MVA-A(GenBank注册号：EFl28033)和液泡膜H<'+>-PPase基因M-PPi(GenBank注册号：DQ989335)的全长cDNA序列，以及PEPC基因的部分cDNA序列。 1)M-ME编码区全长2048 bp，编码一个含有590个氨基酸残基的蛋白质，估计分子量大小为64.98 kD，预测等电点(pI)为5.9。M-ME与其它植物NADP-ME的同源性在90％以上，含有5个与NADP结合有关的高度保守区。 2)．MVA-A编码区全长1872 bp，编码一条623个氨基酸残基的多肽链，分子量约68.9 kD。MVA-A与拟南芥、番茄、胡萝卜、棉花、绿豆等草本植物的同源性均高于90％；与梨、桃、蜜橘等果树的同源性达到95％以上，其中和梨的同源性高达99.20％，仅有6个氨基酸残基存在差异；其氨基酸序列中存在一段富含甘氨酸的保守序列GAFGCGKT(252-259 aa)。 3)M-PPi编码区全长2280 bp，编码一条759个氨基酸残基的多肽链，分子量约79.4 kD。M-PPi与拟南芥、水稻、大麦、玉米、绿豆、桃、梨、葡萄等陆生植物的同源性都在80％以上，含有DVGADLVGKVE(246-256 aa)、TEYYTS(415-420 aa)和GDTIGD(715-720 aa)三个保守序列。亲水性分析发现存在14个跨膜区。 4)PEPC的cDNA片断长3084 bp，含有3'-Poly(A)尾巴，同预计cDNA全长相差110 bp左右，推导氨基酸序列同其它物种有较高同源性。 2．PEPC在高酸基因型果实中的转录水平随着果实发育趋于下降，在低酸基因型果实中其转录水平趋于增加。两种基因型之间相比较，花后30～90天该基因在高酸果实中的转录显著高于低酸果实，而花后90～150天两种基因型之间的差异不明显。 3．M-ME在高酸基因型果实中转录水平随着果实发育趋于降低；在低酸基因型果实中，其转录呈双峰曲线，分别在花后60和120天出现两个转录高峰。花后60～150天．M-ME在高酸基因型果实中的转录水平一直低于低酸果实。 4．MVA-A在高酸基因型果实中转录水平逐渐降低；而低酸基因型果实中该基因的转录水平趋于增加。花后30～60天，高酸基因型果实中MVA-A的转录水平显著高于低酸果实；但在花后90～150天，高酸基因型果实中该基因的转录水平则低于低酸果实。 5．M-PPi在高酸基因型果实中转录水平随着果实发育趋于降低；在低酸基因型果实中，其转录水平一直维持在一个较低水平。就两种基因型而言，M-PPi在高酸基因型果实中的转录水平一直高于低酸果实。 6．重组载体pET30a-ME转化表达菌株BL21后，用IPTG诱导表达一条约66 kD的融合蛋白，诱导8h后其表达量最大。

目录

论文说明：英文缩写符号及其中英文对照表

声明

1引言

1.1植物体中有机酸代谢及功能

1.2.苹果果实中有机酸代谢

1.2.1苹果果实中有机酸的种类

1.2.2苹果果实发育过程中有机酸含量的变化

1.2.3苹果果实中苹果酸代谢途径

1.3苹果果实酸/低酸性状遗传研究

1.4苹果酸代谢关键酶研究进展

1.4.1磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)研究进展

1.4.2NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）研究进展

1.4.3细胞质NADP-苹果酸酶（NADP-ME）研究进展

1.4.4植物液泡膜H+-ATPase研究进展

1.4.5植物液泡膜H+-PPase研究进展

1.5本研究的目的意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株和质粒

2.1.3酶及生化试剂

2.1.4培养基

2.1.5 PCR引物

2.2实验方法

2.2.1苹果果实中苹果酸含量的测定

2.2.2热硼酸法提取RNA

2.2.3 RNA含量和纯度检测

2.2.4 cDNA第一链的合成

2.2.5反转录产物质量检测

2.2.6 cDNA纯化

2.2.7 cDNA末端加尾

2.2.8 PCR扩增条件和程序

2.2.9 PCR扩增产物的回收

2.2.10 PCR产物的克隆

2.2.11 cDNA序列测定

2.2.12原核表达细胞质型苹果酸酶蛋白

2.2.13实时荧光定量PCR

3结果与分析

3.1苹果果实不同发育阶段苹果酸含量测定

3.2 RNA的提取和质量检测

3.3反转录产物质量检测

3.4苹果细胞质型NADP-ME基因(M-ME)的克隆与表达分析

3.4.1苹果细胞质型NADP-ME基因的克隆

3.4.2 M-ME序列分析

3.4.3 M-ME原核表达分析

3.5磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)cDNA片断的克隆

3.6液泡膜H+-ATPase A亚基基因(VHA-A)的克隆及序列分析

3.6.1液泡膜H+-ATPase A亚基基因的克隆

3.6.2 VHA-A序列分析

3.7液泡膜H+-PPase基因(V-PPi)克隆及序列分析

3.7.1液泡膜H+-PPase基因的克隆

3.7.2 V-PPi氨基酸序列分析

3.8定量PCR结果分析

3.8.1 PEPC定量PCR分析

3.8.2 M-ME定量PCR分析

3.8.3 MVA-A定量PCR分析

3.8.4 M-PPi定量PCR分析

4讨论

4.1苹果果实中有机酸的积累模式

4.2苹果果实中糖、酸代谢和影响因素

4.3苹果酸代谢和储藏关键酶基因的序列分析

4.4苹果酸不同积累模式形成的可能机制

5结论

下一步研究设想

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文