CD134单抗对SLE患者外周血单个核细胞穿孔素表达及其活性的影响

摘要

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种累及全身各个系统的自身免疫性疾病。其慢性化临床表现至今仍是对多数临床工作者的挑战。SLE以育龄期女性高发，可以引起流产、死胎和新生儿狼疮，造成严重社会危害。目前以免疫抑制治疗为主，小部分患者可长期缓解，一部分患者病情慢性化，还有一部分患者病情急剧恶化，最终死于感染、狼疮脑病或肾功能衰竭。SLE的病因和发病机制尚未完全清楚，可能是携带某些遗传因素的易患者，在环境因素和性激素影响下，发生了异常的免疫应答反应。SLE患者循环B细胞的数量并未增加，而分化状态改变使B细胞处于高度活跃状态，患者体内可以检测到多种自身抗体，如抗细胞内DNA及多种核蛋白的抗体、抗细胞膜成分的抗体。抗体与抗原结合形成的免疫复合物在靶细胞沉积，造成以Ⅲ型变态反应为主的免疫损伤。B细胞活跃的一个原因是抗原刺激的结果，即由于体内凋亡的细胞数增加及受损伤的细胞内成分泄漏，形成大量自身抗原：另一个原因是T细胞调节障碍，辅助性T细胞(CD4+T细胞)参与自身抗原的识别<'[1,2]>。T细胞功能异常是SLE发病机制的中心环节。动物实验表明CD8+T细胞参与了SLE的发病，或者作为细胞反应的有毒成分直接参与，或者通过克服耐受自身抗原的机制间接参与<'[3,4]>。在实验性SLE模型中，清除了主要组织相容性复合体Ⅰ抗原表达缺陷的CD8+T细胞的小鼠对疾病有抵抗性<'[5]>。敲除了主要组织相容性复合体I(β<,2>微球蛋白)基因的NZB小鼠与正常NZB小鼠相比抗红细胞抗体产生延迟、滴度下降<'[6]>。而如果敲除了Ⅰ型干扰素受体基因，不仅NZB小鼠脾脏中的CD8+细胞明显减少，而且会减轻SLE的病情<'[7]>。最近，Blanco等的研究发现在SLE病人体内CD8+细胞毒T淋巴细胞的数量和功能均增加，不仅与疾病的活动性呈很强的相关性，而且促进了患者体内大量自身抗原的产生<'[8]>。活化的CD8+T细胞不仅参与了SLE的发病，而且表达穿孔素，Michael等发现PF阳性T细胞都是cD8阳性细胞毒T细胞，并且通过体外实验证实应用特异性抗体刺激后PF阳性T细胞的数量随之增加，因而可以将穿孔素作为CD8+T细胞活化的标志<'[9]>。穿孔素(Perforin，PF)又称为孔形成蛋白(pore-forming protein，PFP)，是一种糖蛋白，主要存在于细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)和NK细胞胞浆颗粒中，能在靶细胞膜上聚集形成孔道。无机离子及过多的水分通过孔道进入细胞，导致细胞肿胀，某些酶和细胞因子，也可以有孔道进入，共同促成细胞死亡。细胞死亡的方式分为以上两种：①细胞凋亡，是一种由基因控制的细胞自主性死亡过程。凋亡过程中细胞膜和核膜保持完整，不引起炎症反应。②细胞坏死，是细胞突发性病理性死亡或生理环境急剧变化(如高热、缺氧等)所致。坏死过程中细胞发生不可逆的变性，最终细胞解体，释放细胞内容物包括溶酶体酶，诱发邻近组织炎症反应。有人对系统性红斑狼疮患者淋巴细胞凋亡及其与自身抗体的关系进行研究，认为SLE活动期患者细胞凋亡加快，凋亡过程中暴露出．许多自身抗原刺激免疫细胞产生抗体。SLE往往表现为多个器官的持续性炎症反应，未发现抗原抗体复合物沉积的部位如心肌也有炎症反应发生，与凋亡理论认为凋亡过程不引起炎症反应相矛盾。而细胞坏死释放细胞碎片，刺激自身免疫应答，似乎更能较全面的解释炎症性细胞因子和大量自身抗体的产生。PF既能导致细胞溶解性坏死又诱发细胞凋亡。对sLE活动期患者外周血单个核细胞PF mRNA的检测发现，患者PFmRNA的表达水平升高，且与疾病活动度正相关。但是同时测定NK细胞的杀伤活性，发现SLE活动期患者的NK细胞杀伤活性低于正常对照组，这一结果与NK细胞是释放PF的主要细胞的观点相矛盾。Blanco等证实在SLE患者体内不仅CD8+T细胞数量增加，PF的数量亦随之增加<'[8]>。PF在SLE发病中的作用已经证明<'[10]>，所以PF可能成为这类疾病治疗的新靶点<'[11]>。有人发现肿瘤坏死因子受体(tumor necrosisfactor receptor，TNFR)超家族成员可以抑制PF的表达。Muta等在体外实验中用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PCR)的方法证实CD30下调PF mRNA的表达<'[12]>。CD134是TNFR超家族成员之一，为I型跨膜糖蛋白，相对分子质量约为48000～50000。人的CD134基因于1994年克隆，长约1.4kb，编码一个相对分子质量为27777的含227个氨基酸的膜蛋白，与其他TNFR超家族成员CD30、4-1BB、TNFR Ⅱ和DR3成簇位于1号染色体lp36的远侧端，但是否具有和其他同族成员相似的功能，是否可以抑制PF的表达和其活性尚未见报道。本试验目的在于观察SLE患者外周血PF的表达及其活性，证实PF在SLE发病中的作用；研究CD134单抗对PF表达及其活性的影响，寻找最佳作用浓度及时间，应用于SLE患者，并将之与甲基强的松龙(Methylprendisolone，MP)作用相对比，探索SLE治疗的新靶点，促进细胞因子的产业化。

目录

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符号说明

前言

第一部分：CD134单抗对植物血凝素诱导的外周血单个核细胞穿孔素表达及其活性的影响

研究对象和方法

结果

讨论

小结

参考文献（一）

第二部分：CD134单抗对SLE患者外周血单个核细胞穿孔素表达及其活性的影响

研究对象和方法

结果

讨论

小结

参考文献（二）

结论及意义

致谢

攻读学位期间发表及已录用论文

发表论文一

发表论文二