基质金属蛋白酶抑制剂分子生物色谱筛选方法的研究和应用

摘要

目的：恶性肿瘤能浸润其它组织并形成瘤块，是引起人类死亡的重大疾病之一。研究发现，肿瘤细胞产生和释放多种水解酶降解细胞外基质（ECM）或基底膜（BM）可能是浸润与转移的主要内容。以明胶酶为靶点来设计、合成明胶酶抑制剂已经成为抗癌药物研究的热点课题。本文建立了固定化明胶酶分子生物色谱法，并应用于一批化合物的筛选。 方法：分别选择色谱硅胶、整体柱为两种载体，制备固定化明胶酶反应器。以硅胶为载体的固定化明胶酶反应器的制备：L8（27）正交试验考察固定化明胶酶的制备条件，考察因素包括明胶酶浓度、明胶酶量、缓冲溶液浓度以及pH，考察指标为键合率、酶活性，之后考察固定化明胶酶最佳活性条件。在柱上经键合、冲洗、饱和，将明胶酶键合到分别含环氧基或醛基的色谱硅胶上，计算键合率。通过接取流出液比色和加入抑制剂比较产物峰面积变化两种方法确定产物峰的位置，考察流速对产物的影响，测定酶的特征参数——Km，考察柱子的稳定性。以整体柱为载体的固定化明胶酶反应器的制备：采用溶胶．凝胶法，TMOS为硅胶原料，PEG为相分离促进剂，乙酸、氨水和DMF分别作为水解催化剂、中孔制孔剂和干燥控制剂制备整体柱。从凝胶化时间、TMOS/PEG、制孔剂浓度和陈化时间等方面考察制备工艺，以骨架和通孔尺寸、中孔尺寸、硅羟基含量等作为考察指标。经聚四氟乙烯包覆安装于色谱系统中，测得孔隙率。再通过环氧基或醛基偶联将明胶酶键合到整体柱上，进样底物，确定产物峰的位置，考察酶浓度对键合率影响、流速对产物的影响，测定其Km，考察柱子稳定性。筛选抑制剂：以LY52为阳性对照，用以上建立的方法测定其IC50，与文献值和比色法测定值比较，同时制作量—效曲线，验证筛选模型的可行性，并考察精密度。用该两种色谱法测定另外439个化合物的IC50，并与比色法比较。 结果：正交设计试验所得固定化明胶酶制备条件为：明胶酶0．5mg/mL，缓冲液0．05mol/L，pH6．0，固定化明胶酶最佳活性条件为：底物300μl、pH8．5、42℃。明胶酶与硅胶反应的键合率分别为28．6mg/g（环氧基）、68．4 mg/g（醛基）。确定保留时间为37．631min的峰为产物峰，最佳流速为0．2mL/min，Km分别为0．63±0．006mmol/L（环氧基）、0．54±0．012mmol/L（醛基），柱子在一周内稳定。综合比较键合率、Km、稳定性发现，醛基为活性基团制备固定化酶反应器更好。溶胶—凝胶法制备整体柱的条件为：TMOS/PEG3．77；120℃1．0mog/L氨水处理；陈化一天，所得整体柱骨架尺寸1．3μm、通孔尺寸2．5μm、中孔尺寸14nm、比表面积264m2/g、硅羟基0．2377 mmol/g、孔隙率81％。明胶酶与整体柱键合，酶浓度以0．3mg/mL最佳，键合率分别为88．6mg/g（环氧基）、90．4 mg/g（醛基）。确定37．409min峰为产物峰，最佳流速为0．2mL/min，Km分别为0．28±0．005mmol/L（环氧基）、0．21±0．008mmol/L（醛基），柱子在一个月内稳定。综合比较键合率、Km、稳定性发现，两种活性基团差别不大，因环氧基制备简单，选择环氧基偶联整体柱制备固定化酶反应器。色谱法测定LY52的IC50分别为0．018±0．0001μmol/L（色谱硅胶）、0．021±0．0001μmol/L（整体柱），比色法测得值和文献值分别为0．023±0．0004μmol/L、0．027±0．0004μmol/L，三者基本一致，量—效关系也良好，表明筛选模型是可行的。对另外39个化合物，两种色谱法和比色法测定结果整体趋势保持一致，但总体上以硅胶为载体的色谱法结果略微偏高，整体柱为载体的色谱法筛选效果更好。 结论：本文分别以色谱硅胶、硅胶整体柱——两种载体建立的筛选方法是可行的，能够实现对大量多组分化合物快速筛选。

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前言

1.基质金属蛋白酶

1.1 MMPs分类、调节与功能

1.2 MMPs水解底物机理

2.基质金属蛋白酶抑制剂

2.1 MMPIs的分类

2.2异羟肟酸类MMPIs

3.基质金属蛋白酶及其抑制剂的活性测定方法

3.1传统方法

3.2分子生物色谱法

第一章 以硅胶为载体的固定化明胶酶反应器筛选明胶酶抑制剂

仪器与试剂

1.仪器

2.材料

方法与结果

1.游离明胶酶动力学性质的考察

2.以硅胶为载体的明胶酶硅胶固定相制备条件的考察

3.制备固定化明胶酶反应器

4筛选抑制剂

第二章 以硅胶整体柱为载体的固定化酶反应器筛选明胶酶抑制剂

仪器与材料

1.仪器

2.材料

方法与结果

1.硅胶整体柱制备工艺的考察

2.硅胶整体柱的包覆和孔隙率的测定

3.以硅胶整体柱为载体的固定化酶反应器的制备

4.筛选抑制剂

全文总结

展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文