重要致病性弧菌TaqMan实时PCR检测方法的建立

摘要

[目的]： 建立重要致病性弧菌TaqMan实时PCR检测方法，具体包括： （1）霍乱弧菌和拟态弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法 （2）O1群和0139群霍乱弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法 （3）霍乱毒素基因（ctx）TaqMan实时PCR检测方法 （4）副溶血弧菌TaqMan实时PCR检测方法 （5）耐热直接溶血素基因（tdh）和耐热直接溶血素相关溶血素基因（trh） 双重TaqMan实时PCR检测方法 （6）创伤弧菌和溶藻弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法 （7）霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR检测方法 （8）嗜水气单胞菌TaqMan实时PCR检测方法。 [方法]： 对“目的”中涉及的前7个实时PCR检测方法，本研究采取如下实验方案： （1）查阅文献确定待检测的目的基因，通过序列比对确定待检基因的保守序列，然后借助引物探针设计软件Beacon Designer7.0设计单重和（或）双重TaqMan实时PCR引物和探针。 （2）引物扩增待测基因，PCR产物经胶回收后与T载体连接制备扩增产物克隆子，挑选阳性克隆子提取质粒，测序确认。用EasyDilution将上述质粒依次稀释成1.0×1010拷贝/μl—1.0×100拷贝/μl。 （3）分别在100—1000 nmol/L10个浓度梯度和100—500 nmol/L5个浓度梯度内，借助方差分析优化引物和探针的浓度。 （4）单重实时PCR灵敏度和特异度的评价。 （5）以1.0×108拷贝/μl—1.0×100拷贝/μl9个浓度梯度的质粒为模板，每个浓度梯度做8个平行样，在伯乐公司的CFX96荧光定量PCR仪上进行扩增，确定单重实时PCR反应体系的检测下限以及扩增效率。 （6）将优化了的单重实时PCR反应体系组合成双重TaqMan实时PCR反应体系，并对双重实时PCR的检测下限进行评价。 对嗜水气单胞菌TaqMan实时PCR检测方法，检测下限的评价包括菌液的检测下限和DNA的检测下限。将一系列稀释度的嗜水气单胞菌菌液人工污染健康人的粪便，评价该检测方法从未经增菌处理的粪便中以及增菌3小时、8小时和16小时的粪便中检测出嗜水气单胞菌的能力。 [结果]： 建立了重要致病性弧菌的TaqMan实时PCR检测方法。具体结果为： （1）霍乱弧菌外膜蛋白W基因（out membrane protein W，ompW）和拟态弧菌的溶血素基因（Vibrio mimicus hemolysin，vmh）作为霍乱弧菌和拟态弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法的待检基因。优化的反应体系中，霍乱弧菌引物和探针的浓度分别为100 nmol/L和200 nmol/L；拟态弧菌引物和探针的浓度分别为100 nmol/L和100 nmol/L。该反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl，扩增效率分别为：100.9%和99.7%。 （2）O1和O139的O抗原合成基因rfb基因作为O1群和O139群霍乱弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法的待检基因。优化的反应体系中，O1的引物和探针的浓度均为200 nmol/L； O139的引物和探针的浓度均为200 nmol/L。该反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl，扩增效率分别为：101.4%和99.9%。 （3）优化的霍乱毒素基因实时PCR反应体系中，ctx引物和探针的浓度均为200 nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对ctx质粒模板的检测下限为1.0×102拷贝/μl，扩增效率为99.8%。 （4）副溶血弧菌的toxR基因被选作副溶血弧菌的特异性基因。优化的toxR引物和探针的浓度分别为200 nmol/L和100 nmol/L；反应体系的灵敏度和特异度均为100%。该反应体系对toxR质粒模板的检测下限为1.0×102拷贝/μl，扩增效率为100.1%。 （5）优化的tdh和trh双重TaqMan实时PCR反应体系中，tdh引物和探针的浓度分别为200 nmol/L和100 nmol/L； trh引物和探针的浓度分别为200 nmol/L和100 nmol/L。该反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl，扩增效率分别为：97.3%和100.1%。 （6）创伤弧菌的溶血素基因（Vibrio vulnificus hemolysin，vvh）和溶藻弧菌的胶原酶基因（Vibrio alginolyticus collagenase，col）被选作为创伤弧菌和溶藻弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法的待检基因。优化的反应体系中，创伤弧菌引物和探针的浓度均为200 nmol/L；溶藻弧菌引物和探针的浓度均为200 nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl，扩增效率分别为：100.5%和101.5%。 （7）优化的tdh和ct双重TaqMan实时PCR反应体系中，ct引物和探针的浓度分别为200 nmol/L和100 nmol/L； tdh引物和探针的浓度分别为200 nmol/L和100 nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl，扩增效率分别为：94%和97.7%。 （8）嗜水气单胞菌的主要粘附素基因（Aeromonas hydrophila major adhesion gene，aha）被选为嗜水气单胞菌的特异性基因。优化的引物和探针的浓度分别为200 nmol/L和100 nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。该反应体系对纯培养物DNA的检测下限为1 pg/μl，对菌液的检测下限为80 CFU/ml。对未经增菌的人工污染粪便标本的检测下限为8×103 CFU/ml，增菌3小时对检测下限没有影响，增菌8小时和16小时后，检测下限能达到8 CFU/ml。 [结论]： 本研究建立了基于TaqMan探针的重要致病性弧菌的实时PCR检测方法。实验结果证明它们具有令人满意的灵敏度和特异度。检测下限能达到1.0×102拷贝/μl，高于普通PCR10—1000倍。并且双重实时PCR能够在一个反应体系中同时检测两种菌或者两个致病基因，大大减少了实验时间和对试剂的消耗。因此，上述检测方法可用于重要致病性弧菌的快速检测及筛查，尤其是当样本量很大或者爆发疫情时。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分:霍乱弧菌和拟态弧菌双重TaqMan实时PCR检测体系的建立

前言

一、霍乱弧菌和拟态弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法的建立

1.材料

2.实验方法及结果

3.讨论

参考文献

二、O1和O139霍乱弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法的建立

1.材料

2.实验方法及结果

3.讨论

参考文献

三、霍乱毒素基因(ctx)TaqMan实时PCR检测方法的建立

1.材料

2.实验方法及结果

3.讨论

参考文献

四、总结

第二部分:副溶血弧菌双重TaqMan实时PCR检测体系的建立

前言

一、副溶血弧菌toxR基因实时PCR检测方法的建立

1.材料

2.实验方法及结果

3.讨论

二、tdh和trh双重TaqMan实时PCR检测体系的建立

1.材料

2.实验方法及结果

3.tdh和trh双重TaqMan实时PCR检测方法的应用

4.讨论

三、小结

参考文献

第三部分:创伤弧菌和溶藻弧菌双重TaqMan实时PCR检测体系的建立

前言

1.材料

2.实验方法及结果

3.讨论

参考文献

第四部分:霍乱毒素基因(ctx)和耐热直接溶血素基因(tdh)双重TaqMan实时PCR检测体系的建立

前言

1.材料

2.实验方法及结果

3.讨论

参考文献

第五部分:嗜水气单胞菌TaqMan实时PCR方法的建立

前言

1.实验材料

2.方法及结果

3.讨论

参考文献

研究总结

附录

致谢

攻读硕士学位期间已发表或待发论文情况